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[Estudios bioquímicos sobre los componentes de la camomila/III. Estudios in vitro sobre la actividad antipéptica de (--)-alfa-bisabolol (transl del autor)]. (--)-Alfa-Bisabolol tiene una acción antipéptica primaria dependiendo de la dosis, que no es causada por una alteración del valor de pH. La actividad proteolítica de la pepsina se reduce en un 50 por ciento por la adición de bisabolol en la proporción de 1/0,5. La acción antipéptica del bisabolol sólo ocurre en caso de contacto directo. En caso de contacto previo con el substrato, se pierde el efecto inhibidor. |
[Demonstración de propiedades inhibidoras del tumor de una sustancia de bajo peso molecular altamente inmunostimulante. Estudios comparativos con ifosfamida en el carcinosarcoma DS inmuno-labile. Estimulación de la actividad autoinmune durante aproximadamente 20 días por BA 1, un N-(2-cianoetileno)-urea. nuevas posibilidades de prevención). Se da un informe sobre el descubrimiento reciente de propiedades inmunológicas sobresalientes en BA 1 [N-(2-cianoetileno)-urea] con una masa molecular (baja) M = 111,104. Experimentos en 214 DS carcinosarcoma llevando ratas Wistar han mostrado que BA 1, a una dosis de sólo alrededor del 12 por ciento LD50 (150 mg kg) y letalidad insignificante (1.7 por ciento), resulta en una tasa de recuperación de 40 por ciento sin hiperglucemia y, en una prueba, de 80 por ciento con hiperglucemia. Bajo condiciones no alteradas, la sustancia de referencia ifosfamida (IF) - un desarrollo adicional de la ciclofosfamida - aplicada sin hiperglucemia en su dosis más eficiente del 47 por ciento LD50 (150 mg kg) produjo una tasa de recuperación del 25 por ciento con una letalidad del 18 por ciento. (A diferencia de BA 1, la hiperglucemia de 250 minutos no causó una mejora adicional en la tasa de recuperación.) Sin embargo, esta comparación se caracteriza por el hecho de que ambas sustancias exhiben dos mecanismos de acción bastante diferentes (complementarios). Los recuentos de leucocitos realizados después de la aplicación de dichos cancerostáticos y dosis han mostrado una estimulación pronunciada con BA 1 y con ifosfamida, la supresión conocida en el intervalo post-terapéutico generalmente encontrado con los cancerostáticos estándar. En combinación con la prueba de placa citada para BA 1, las fotografías de sangre luego permiten conclusiones sobre el estado de inmunidad. Dado que IF se puede considerar como uno de los carcinógenos más eficientes - no hay otro quimioterápico conocido hasta ahora que tenga un efecto más significativo en el carcinosarcoma DS en ratas - estos hallazgos son de especial importancia. Finalmente, la cantidad total de leucocitos y linfocitos, así como su comportamiento en el tiempo, se determinó a partir del cuadro sanguíneo de las ratas libres de tumor después de la aplicación intravenosa de BA 1. Los valores numéricos así obtenidos muestran claramente que el trabajo de investigación adicional sobre el uso profiláctico de esta sustancia parece ser necesario y muy prometedor. |
Efecto de Etabena en el flujo sanguíneo total y regional del miocardio. La distribución del flujo sanguíneo a las capas subendocárdicas, medianas y subepicárdicas de la pared libre ventricular izquierda se estudió en perros anestesiados bajo condiciones normoxicas (A), hipóxicas (B) y bajo vasodilación coronaria farmacológicamente inducida (etafenona) (C). El flujo sanguíneo regional del miocardio se determinó mediante el método de distribución de partículas. En la normoxia se observó un gradiente de flujo transmural, con las capas subendocárdicas recibiendo una tasa de flujo significativamente mayor en comparación con las capas subepicárdicas. En la vasodilatación inducida por hipoxia, este gradiente de flujo transmural era persistente. En contraste, se observó una marcada redistribución del flujo regional con vasodilatación inducida farmacológicamente. El gradiente transmural disminuyó. En contraste con algunos hallazgos, estos experimentos demuestran que existe una considerable capacidad vasodilatoria en todas las capas del miocardio y puede ser utilizada por los fármacos. Las diferencias observadas para el patrón de distribución intramural del flujo bajo hipoxia y vasodilatación inducida por fármacos apoyan la hipótesis de que este patrón refleja los gradientes correspondientes del metabolismo del miocardio regional. |
Influencia de un nuevo compuesto virostático en la inducción de enzimas en el hígado de ratas. El compuesto virostático N,N-diethyl-4-[2-(2-oxo-3-tetradecyl-1-imidazolidinyl)-ethyl]-1-piperazinecarboxamide-hidrocloruro (5531) se analizó en cuanto a su efecto en la inducción de la triptofan-pirrolasa y la tirosina aminotransferasa en el hígado de ratas. La actividad básica de las enzimas no fue afectada por la sustancia ni en animales normales ni en animales adrenalectomizados. La inducción de las enzimas por la cortisona aumentó en presencia del compuesto mientras que la inducción del substrato permaneció inalterada. La inducción de la tirosina-aminotransferasa por el dexametasonefosfato en la cultura de tejidos se inhibe si la dosis del compuesto 5531 es superior a 5 mug/ml. |
Propiedades farmacológicas de los nuevos compuestos neurolépticos. RMI 61 140, RMI 61 144 y RMI 61 280 son recientemente sintetizados N-[8-R-dibenzo(b,f)oxepina-10-yl]-N'-metil-piperazina-maleatas que muestran efectos psicofarmacológicos interesantes. Este trabajo contiene los resultados de un estudio realizado con estos tres compuestos, con el fin de demostrar su actividad neuropsicoléptica en comparación con la cloropromazina (CPZ) y el clordiazepoxido (CPD). La inhibición de la motilidad observada en ratones muestra que los compuestos reducen la motilidad espontánea normal, así como el tono muscular. La actividad central-depresiva se evidencia por un aumento del sueño inducido por barbitúricos y también se puede observar una notable ptosis de las pálpebras. Nuestros compuestos no muestran ninguna actividad en el electrochoque, al igual que el CPZ y el CPD. En cuanto al esquema antipsicótico, nuestros compuestos muestran una fuerte reducción de la letalidad debido a la amfetamina en ratones agrupados y una fuerte actividad antiapomorfina. También muestran un efecto antiagresivo y una actividad inhibidora en el comportamiento de evasión mucho más fuerte que el CPZ. También encontramos efectos extrapiramidales, como la catalepsia, comunes a muchos tranquilizantes del tipo de estándares utilizados por nosotros. En cuanto a los fenómenos vegetativos, los compuestos muestran una acción hipotensiva relacionada con la dosis que va de moderada a fuerte, probablemente debido a una inhibición del receptor a. La actividad adrenolítica contra dosis letales de adrenalina, antiserotonina y efectos antihistamínicos, así como otras acciones (hipotermia, analgesia, etc.) confirman que RMI 61 140, RMI 61 144 y RMI 61 280 están dotados de propiedades farmacológicas similares y más potentes que las de CPZ. Los estudios sobre el metabolismo de las catecolaminas cerebrales muestran que son similares a la CPZ, aunque con menos efecto en los niveles de dopamina. |
[Estudios sobre la acción de un agente anticolinérgico en combinación con un tranquilizante en la secreción de jugo gástrico en el hombre]. Se realizó un estudio doble ciego con comparaciones intra-individuales para investigar los efectos de 15 mg (8r)-3alfa-hidroxi-8-isopropil-1alfaH-tropato bromuro(+/-) (Sch 1000), 15 mg Sch 1000 + 10 mg oxazepam, 10 mg oxazepam y placebo con administración oral en secuencia aleatoria sobre el volumen del jugo gástrico, la cantidad de ácido, la concentración y los valores de pH en 12 voluntarios sanos. Los parámetros de secreción se medieron durante un período basal de 1 h y un período de estimulación de 2 h. El jugo gástrico se obtuvo en 15 minutos porciones a través del tubo gástrico. La estimulación se efectuó con 1 mug/kg/h de pentagastrina mediante infusión de gotas. El test de Friedman se utilizó para la evaluación estadística comparativa, y las comparaciones individuales se realizaron mediante el test de Wilcoxon (rango de parejas-diferencias). Los resultados muestran que Sch 1000 y Sch 1000 + oxazepam fueron iguales en efecto sobre el volumen de secreción basal y estimulada. En comparación con el placebo, no fue posible establecer un efecto sobre el volumen de secreción de oxazepam solo. Se encontró que Sch 1000 y Sch 1000 + oxazepam eran equipotentes en la reducción de la cantidad de ácido basal, mientras que oxazepam redujo esta cantidad sólo durante los primeros 30 minutos de secreción basal. Ninguna de las tres preparaciones activas fue capaz de inhibir el ácido estimulado, aunque ambas preparaciones de Sch 1000 produjeron una clara tendencia hacia los valores medios bajos. Durante el período de secreción basal, los tres preparados de ensayo tenían una acción inhibidora sobre la concentración de ácido, pero ninguno de ellos tuvo un efecto significativo durante el período de estimulación. El valor de pH fue aumentado fácilmente sólo por Sch 1000 y Sch 1000 + oxazepam, y esto incluso sólo durante el período basal. Se discuten los resultados. |
Hidrolases lisosomales de la epidermis. I. Las glicoproteínas Se han caracterizado siete glicosidases distintas (EC 3.2) en la epidermis de la guinea porcina. Sus propiedades indican que son de origen lysosomal. El 'perfil' de las glicosidases epidermales es significativamente diferente de lo reportado para la piel entera, las actividades de la beta-galactosidasa y la beta-acetylglucosaminidase siendo muy alta y las de las enzimas restantes relativamente bajas en la epidermis. |
Hidrolas lisosomales de la epidermis. Ester Hidrolases de agua. Se han caracterizado cinco hidrolases de éster distintos (EC 3-1) en la epidermis de guinea porcina. Estas son la esterasa carboxílico, la fosfatasa ácida, la pirofosfatasa y la arilsulfatasa A y B. Sus propiedades son consistentes con las de las enzimas lisosómicas. |
Una propiedad hemaglutinante sérica dependiente de los grupos policarboxílicos. Se ha reportado una aglutinina sérica reactiva con glóbulos rojos en presencia de grupos policarboxilos. Es probable que esto represente un ejemplo adicional del tipo de aglutinina anteriormente descrito como aglutinando células rojas en ausencia de calcio ionizado. Se presentan evidencias experimentales que indican que son los grupos policarboxílicos libres los que potencian la aglutinación y que cualquier ion metálico, como el calcio, capaz de quelar con estos grupos, resultará ser inhibidor. |
Efecto del estroma de eritrocitos humanos en la activación del complemento. El estroma de células rojas normales o similares al PNH es capaz de inhibir, en cierta medida, la lisis en la prueba de sacarosa y potenciar la lisis en la prueba de suero acidificado. Los mismos efectos opuestos se muestran por los picos de exclusión de Sephadex G-200 obtenidos de cada preparación de estroma, lo que sugiere que el mismo factor podría ser responsable de ambas actividades. Stromata y picos también inducen la lisis de células semejantes a PNH en el suero no acidificado, lo que indica la activación del complemento a través de la vía alternativa. Esto es confirmado por la observación inmunoelectroforética. Cuando se utiliza un soro activado previamente a través de la vía alternativa en la prueba de sacarosa, la cantidad de lisis se reduce notablemente. Esto indicaría que la activación de la vía clásica puede ser controlada por la vía alternativa. Se discute la posible importancia clínica de estos factores en la determinación de la crisis hemolítica en pacientes con PNH. |
El efecto del o-salicilato en la actividad de la vía de fosfato de pentosa en las células rojas normales y con deficiencia de G6PD. Se ha estudiado el efecto del metabolito principal de la aspirina, es decir, el ácido salicílico, en la vía de fosfato de pentosa (PPP) de los glóbulos rojos normales y con deficiencia de G6PD. Se ha demostrado que el ácido salicílico inhibe esta vía en proporción a la cantidad presente. En cualquier concentración de esta sustancia, se observó una mayor inhibición del PPP en las personas con deficiencia de G6PD que en las células rojas normales. |
Los efectos del procesamiento de los suplementos a base de cebada en el pH de la cebada, la tasa de digestión de la ingesta voluntaria de hierba seca en las ovejas. En un experimento se estudió el efecto sobre el pH del rumen de la alimentación con cantidades limitadas de cebada entera o granulada. Con la cebada entera hubo poca variación en el pH de la cebada asociado con el tiempo de alimentación, pero con la cebada granulada el pH disminuyó de unos 7-0 antes de la alimentación a unos 5-3, 2-3 h después de la alimentación. La tasa de desaparición de la hierba seca durante la incubación en los rumiantes de ovejas que recibieron cebada entera o granulada se estudió en un segundo experimento. Después de la incubación de 24 horas, sólo 423 mg/g incubado había desaparecido en el rumen de ovejas que recibían cebada pelletada, mientras que 625 mg/g incubado había desaparecido cuando se incubó en el rumen de ovejas que recibían cebada entera. La ingesta voluntaria de hierba seca de corderos se estudió en un tercer experimento cuando recibieron suplementos de 25 o 50 g de cebada entera o granulada/kg de peso vivo 0-75. En el nivel alto, la cebada pelletada redujo la ingesta de hierba seca en 534 g/kg, pero la cebada entera la redujo en sólo 352 g/kg. La digestibilidad de la fibra de detergente ácido se redujo más por la cebada pelletada que por la cebada entera, pero hubo una tendencia a un pequeño aumento en la digestibilidad de la cebada debido al procesamiento. Se discuten las implicaciones de estos hallazgos en la suplementación de los cereales crudos con cereales. |
Polio (8-aminoguanílico): formación de autoestructuras ordenadas e interacción con polio (ácido citidílico). Poly (8-aminoguanílico ácido) tiene en solución neutra una nueva estructura ordenada de alta estabilidad. El grupo de 8 amino permite la formación de tres enlaces de hidrógeno entre dos residuos a lo largo del "top", o eje largo, de las purinas. Los protones de enlace de hidrógeno habituales y los sitios de acoplamiento de Watson-Crick no están involucrados en la asociación. El esquema de enlace tiene un eje de rotación doble y es hemiprotonado en N(7). Poly(8NH2G) se convierte por titulación alcalina (pK = 9,7) a una estructura ordenada bastante diferente, que es la forma favorecida en el rango de aproximadamente pH 10-11. El esquema de unión parece estar compuesto por un conjunto plano, tetramerico de residuos de guanina, en el que el grupo 8-amino no participa en la unión interbase del hidrógeno. Poly (8NH2G) no interactúa con poli(C) en solución neutra debido a la alta estabilidad de la autoestructura de la G-G hemiprotonada. La titulación a la meseta alcalina, sin embargo, permite la formación de una hélice de Watson-Crick de dos filas. A diferencia del monómero 8NH2GMP, poli(8NH2G) no forma una triple hélice con poli(C) en ninguna circunstancia. Las propiedades de las estructuras ordenadas se interpretan en términos de una fuerte tendencia del grupo 8-amino a formar un tercer enlace interbase de hidrógeno, cuando esta posibilidad no es impedida por el alto pH. |
Efecto del pH en las constantes cinéticas del substrato e inhibidor de la alanina aminopeptidasa hepática humana. Evidencia de dos grupos de centros activos ionizables. La presencia de al menos dos grupos de centros activos ionizables ha sido detectada por un estudio del efecto del pH en la catálisis de la hidrólisis de L-alanil-beta-naphthylamide por la alanina aminopeptidasa hepática humana y en la inhibición de la hidrólisis por inhibidores y análogos de sustrato. Se ha encontrado que los inhibidores de ácido octanoico, octilamina y péptido son inhibidores competitivos y, por lo tanto, se cree que se unen al centro activo. Se ha demostrado anteriormente que L-Phe se une al centro activo ya que se ha encontrado que es un inhibidor competitivo de la hidrólisis de sustratos de tripéptidos (Garner, C. W., y Behal, F. J. (1975), Bioquímica 14, 3208). Un plano de pKm vs. pH para el substrato L-Ala-beta-naphthylamide mostró que la unión disminuyó por debajo del pH de 5,9 y por encima de 7,5, los puntos en los que la curva teórica sufre un cambio integral en la inclinación. Estos puntos se interpretan como el pKa de los grupos ionizables de sustrato o de los grupos centrales activos de enzimas dependientes de la unión. Plotas similares de pKm vs. pH para L-alanyl-p-nitroanilida (como substrato) y pKi vs. pH para L-Leu-Leu-L-L-Leu y D-Leu-L-Tyr (como inhibidores) dieron pares de valores de pKa de 5.8 y 7.4, 6.0 y 7.5, y 5.7 y 7.5, respectivamente. Todos los substratos anteriores (y D-Leu-L-Tyr) tienen valores de pKa cerca de 7.5; por lo tanto, el grupo dependiente de la unión con un valor de pKa cerca de 7.5 es posiblemente este grupo de substrato. Plotas similares de pKi vs. pH para los inhibidores L-Phe, L-Met, L-Leu, octilamina y ácido octanoico tenían sólo un punto de curvatura en 7.7, 7.6, 7.4, 6.3 y 5.9, respectivamente. Los inhibidores de aminoácidos, la octilamina y el ácido octanoico no tienen grupos con valores de pKa entre 5 y 9. Estos datos indican que existen dos grupos activos centrales ionizables con valores de pKa de aproximadamente 6,0 y 7,5, que están involucrados en la unión de sustrato o la unión inhibidora de aminoácidos, pero no en la catálisis ya que Vmax fue constante en todos los valores de pH probados. |
Formación de complejos transitorios en la reacción catalizada de la glutamato deshidrogenasa. La reacción de la glutamato deshidrogenasa y glutamato (gl) con NAD+ y NADP+ se ha estudiado con técnicas de flujo paralizado. La enzima estaba presente en todos los experimentos en exceso de la coenzima. Los resultados indican que el complejo ternario (E-NAD(P)H-kg) está presente como un intermediario en la formación del complejo estable (E-NAD(P)H-gl). La identificación de los complejos se basa en su espectro de absorción. La unión del coenzima a (E-gl) es el paso de limitación de la tasa en la formación de (E-NAD(P)H-kg) mientras que la disociación del alfa-ketoglutarato (kg) de este complejo es el paso de limitación de la tasa en la formación de (E-NAD(P)H-gl). El Km para el glutamato fue 20-25 mM en la primera reacción y 3 mM en la formación del complejo estable. Los valores de Km eran independientes de la coenzima. Las tasas de reacción con NAD+ fueron aproximadamente 50% mayores que las con NADP+. Además, la alta concentración de glutamato inhibía la formación de (E-NADH-kg) mientras que no se encontró inhibición de sustrato con NADP+ como coenzima. ADP mejoró mientras que GTP redujo la tasa de (E-NAD(P)H-gl) formación. La tasa de formación de (E-NAD(P)H-kg) fue inhibida por el ADP, mientras que aumentó en concentraciones altas de glutamato cuando se añadieron pequeñas cantidades de GTP. Los resultados muestran que la mayor actividad encontrada con NAD+ en comparación con NADP+ en condiciones de ensayo de estado estacionario no implica necesariamente la unión de NAD+ al sitio de activación de ADP de la enzima. Además, la inhibición del substrato encontrada en alta concentración de glutamato en condiciones de ensayo de estado estacionario no se debe a la formación de (E-NAD(P)H-gl) ya que este complejo se forma con Km de 3 mM de glutamato, y la inhibición del substrato es sólo significativa en 20-30 veces esta concentración. |
Cerebro humano y placenta colina acetiltransferasa: purificación y propiedades. La acetiltransferasa de colina (EC 2.3.1.6) cataliza la biosíntesis de la acetilcolina según la siguiente ecuación química: acetil-CoA + colina en equilibrio a acetilcolina + CoA. Además del tejido nervioso, la placenta del primate es la única otra fuente animal que contiene acetilcolina y su enzima biosintética. El núcleo cerebral caudato humano y la acetiltransferasa de la colina placentaria humana fueron purificados a la homogeneidad electroforética mediante el intercambio de iones y la cromatografía de afinidad azul dextrano-sefarosa. Los pesos moleculares determinados por la filtración del gel de Sephadex G-150 y la electroforesis del gel de dodecilo de sodio son 67000 más o menos 3000. N-Ethylmaleimide, p-cloromercuribenzoato y dithiobis (2-nitrobenzoico ácido) inhiben la enzima. Dithiothreitol reverte la inhibición producida por los dos últimos reactivos. El pKa del grupo asociado con la inhibición de N-ethylmaleimide es de 8,6 más o menos 0,3. Una acetil-tienzima químicamente competente se puede aislar por filtración de gel de Sephadex. Las enzimas del cerebro y la placenta son hasta ahora físicamente y bioquímicamente indistinguibles. |
Estabilización de la estructura globular del ferricitocromo c por cloruro en disolventes ácidos. Se encontró que el aumento de las concentraciones de cloruro aumenta la resolución entre dos transiciones espectrales de absorción visibles asociadas con la acidificación del ferricitocromo c. El análisis de una variedad de mediciones espectrales y de viscosidad indica que la protonación de un solo grupo con un pK aparente de 2.1 +/- 0,2 y un pK intrínseco de alrededor de 5,3 desplaza el ligando de metionina sin perturbar significativamente la conformación globular nativa. El análisis del ferricitocromo c metilado sugiere que la protonación de un ión carboxilado, más probablemente un residuo de propionato de hemo, es responsable del desplazamiento del ligando de metionina. La adición de un protón a un segundo grupo con un pK aparente de 1,2 +/- 0,1 desplaza el ligando de histidina y despliega la proteína de una conformación globular en una bobina aleatoria. Es más probable que la segunda protonación ocurra en el anillo de imidazol del ligando histidino mismo. Se propone que el cloruro perturbe estas transiciones por ligazón en la quinta posición de coordinación del ión hemo. Tal ligación estabiliza una conformación globular del ferricitocromo c a pH 0,0 y 25 grados. |
Un método de etiquetado competitivo para la determinación de las propiedades químicas de los grupos funcionales solitarios en las proteínas. Las propiedades de los grupos funcionales en una proteína se pueden utilizar como muestras de la estructura de la proteína. Hemos desarrollado un procedimiento general mediante el cual se puede determinar la constante de ionización y la reactividad química de los grupos funcionales solitarios en las proteínas. El método se puede aplicar a la cadena lateral de histidina, tirosina, lisina y cisteína, así como al amino terminus de la proteína. El método, que es una extensión de la técnica de etiquetado competitivo utilizando [3H]- y [14C]1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno (N2ph-F) en un procedimiento de doble etiquetado, es rápido y sensible. Se aprovecha el hecho de que después de la hidrólisis ácida de una proteína dinitrofenilada, se obtiene un derivado que debe derivarse de una posición única en la proteína. El método se ha aplicado al residuo histidino solitario de lysozyme, proteasa alfa-lítica y Streptomyces griseus (S.G.) tripsina, así como al amino terminus de la última proteína. Se obtuvieron los siguientes parámetros para la reacción con N2ph-F a 20 grados C en 0,1 N KCl: la histidina del lisozimo blanco de huevo de pollo, pKa de 6,4 y la constante de velocidad de segundo orden de 0,188 M-1 min-1; la histidina de la proteasa alfa-lítica, pKa de 6,5 y la constante de velocidad de segundo orden de 0,0235 M-1 min-1; la histidina de S.G. trypsin, pKa de 6,5 y la constante de velocidad de segundo orden de 0,0328 M-1 min-1; el terminus amino valil de S.G. trypsin, pKa de 8,1 y la constante de velocidad de segundo orden de 0,403 M-1 min-1. Además, los resultados obtenidos proporcionan pistas sobre los microambientes de estos grupos funcionales, y indican que las proteínas estudiadas sufren cambios de conformidad dependientes del pH que afectan al microambiente, y por lo tanto a la reactividad química de estos grupos. |
Modificación de la arginina y la lisina en las proteínas con 2,4-pentanediones. Las aminas primarias reaccionan con 2,4-pentanediones a pH 6-9 para formar enaminas, N-alquilo-4-amino-3-penten-2-ones. Estos últimos compuestos regeneran fácilmente la amina primaria a un pH bajo o en tratamiento con hidroxilamina. La guanidina y las guanidinas sustituidas reaccionan con la 2,4-pentanediona para formar 2-amino-4,6-dimetilpirimidinas sustituidas por N a una tasa que es inferior por al menos un factor de 20 que la tasa de reacción de la 2,4-pentanediona con las aminas primarias. La modificación selectiva de las cadenas laterales de lisina y arginina en las proteínas se puede lograr fácilmente con 2,4-pentanediona. La modificación de la lisina es favorecida por la reacción en pH 7 o por tiempos de reacción cortos en pH 9. La modificación selectiva de la arginina se logra por reacción con 2,4-pentanediona durante largos períodos en pH 9, seguido por el tratamiento de la proteína con hidroxilamina. El grado de modificación de las cadenas laterales de lisina y arginina se puede medir fácilmente espectroscópicamente. La modificación del lysozyme con 2,4-pentanedione a pH 7 resulta en la modificación de 3,8 residuos de lisina y menos de 0,4 residuos de arginina en 24 horas. La modificación del lysozyme con 2,4-pentanedione a pH 9 resulta en la modificación de 4 residuos de lisina y 4,5 residuos de arginina en 100 h. El tratamiento de esta proteína modificada con hidroxilamina regeneró los residuos de lisina modificados pero no causó cambios en los residuos de arginina modificados. Un residuo de arginina parece ser esencial para la actividad catalítica de la enzima. |
El origen de la inactivación alcalina del pepsinógeno. Por encima del pH de 8,5, el pepsinógeno se convierte en una forma que no puede ser activada a la pepsina en exposición a un pH bajo. La exposición intermedia al pH neutro, sin embargo, devuelve la proteína a una forma que puede ser activada. Se presenta evidencia de un cambio reversible, pequeño de conformidad en la molécula, distinto del despliegue de la proteína. Al mismo tiempo, la molécula se convierte en una forma de solubilidad limitada, que se precipita a un pH bajo, donde normalmente se observa la activación. Los resultados se interpretan en términos de la estructura peculiar de la molécula de pepsinógeno. La titulación de la región terminal básica NH2 produjo una forma abierta, que puede regresar a la forma nativa a pH neutro, pero que se mantiene a un pH bajo por la neutralización de los grupos carboxilados en la porción de pepsina. |
Dihidrofolato reductasa del hígado bovino: propiedades de purificación y de la enzima. Se informa de un procedimiento de purificación para obtener dihidrofolato de hígado bovino reductasa en alto rendimiento y cantidades de 100-200 mg. Un paso clave en el procedimiento es el uso de un gel de afinidad preparado mediante el acoplamiento de pteroyl-L-lysine a Sepharose. La reductasa purificada tiene una actividad específica de aproximadamente 100 unidades/mg y es homogénea según lo juzgado por la ultracentrifugación analítica, la electroforesis del gel de poliacrilamida y la titulación con metotrexato. Los productos de la primera etapa de la degradación Edman indicaron una pureza mínima del 79%. La reductasa tiene un peso molecular de aproximadamente 21500 en base a la composición de aminoácidos y 22100 +/- 300 a partir de la sedimentación de equilibrio. No es inhibido por antisérum a la Streptococcus faecium reductase (isoenzima 2). A diferencia de la reductasa de muchos otros tejidos vertebrados, la enzima bovina es inhibida por mercurio en lugar de activada y tiene un único pH óptimo a la vez que baja y alta fuerza iónica. Sin embargo, la posición del pH óptimo se desplaza y la actividad se incrementa por el aumento de la fuerza iónica. La degradación automática de Edman se ha utilizado para determinar 34 de los 37 residuos de aminoácidos amino-terminales. Existe una homología considerable entre esta región y las regiones correspondientes de la reductasa de S. faecium y de Escherichia coli. Esto refuerza la idea de que esta región contribuye a la estructura del sitio de unión para el dihidrofolato. |
Purificación y propiedades de la Escherichia coli dihidrofolato reductasa. La dihidrofolato reductasa ha sido purificada 40 veces a la homogeneidad aparente de una cepa resistente al trimetoprim de Escherichia coli (RT 500) utilizando un procedimiento que incluye la cromatografía de columna de afinidad al metotrexato. Determinaciones del peso molecular de la enzima basadas en su composición de aminoácidos, velocidad de sedimentación y electroforesis del gel de dodecilo de sodio dieron valores de 17680, 17470 y 18300, respectivamente. Una forma agregada de la enzima con una baja actividad específica puede ser separada del monómero por filtración de gel; el tratamiento del agregado con mercaptoetanol o dithiotreitol resulta en un aumento de la actividad enzimática y una regeneración del monómero. También se han detectado múltiples formas moleculares del monómero por electroforesis de gel de poliacrilamida. La enzima no disuelta exhibe dos pH optima (pH 4.5 y pH 7.0) con dihidrofolato como substrato. Las actividades más altas se observan en los tampones que contienen grandes cationes orgánicos. En 100 mM de cloruro de imidazol (pH 7), la actividad específica es de 47 mumol de dihidrofolato reducido por min por mg a 30 grados. El ácido fólico también sirve como un substrato con un único pH óptimo de 4,5. En este pH, el Km para el folato es 16 muM, y el Vmax es 1/1000 de la tasa observada con el dihidrofolato como substrato. Los cationes monovalentes (Na+, K+, Rb+, y Cs+) inhiben la dihidrofolato reductasa; a una fuerza iónica dada, el grado de inhibición es una función del radio iónico del catión. Los cationes divalentes son inhibidores más potentes; el I50 de BaCl2 es de 250 mM, en comparación con 125 mM para KCl. Los aniones no inhiben ni activan la enzima. |
La influencia del pH en la interacción de los inhibidores con la isomerasa del triosfato y la determinación del pKa del grupo carboxilo del sitio activo. Los efectos de la ionización en la unión de los análogos del estado de transición potencial 2-fosfoglicolato y 2-fosfoglicolohidroxamato parecen atribuirse al cambio del estado de ionización de los ligandos mismos, por lo que no es necesario postular la participación adicional de un residuo ionizante en el sitio activo de la isomerasa de triosefosfato para explicar la influencia del cambio de pH en Ki en el rango neutro. La unión del inhibidor competitivo de sulfato inorgánico es insensible al cambio del pH en el rango neutro. 3-Chloroacetol sulfato, sintetizado como un reactivo específico del sitio activo para la triosefosfato isomerasa, se utiliza para proporcionar una indicación del pKa del grupo carboxilo esencial de esta enzima. Los reactivos específicos del sitio activo descritos anteriormente para la isomerasa eran ésteres de fosfato, y su estado de ionización cambiante (acompañado de posibles cambios en su afinidad para el sitio activo) puede haber complicado los intentos anteriores de determinar el pKa del grupo carboxilo esencial de la dependencia del pH de la tasa de inactivación. Como un ácido monoprótico fuerte, el sulfato de cloroacetol es más adecuado para la determinación del pKa del grupo carboxilo. El sulfato de cloroacetol inactiva la isomerasa de triosefosfato por la esterificación selectiva del mismo grupo carboxílico que el que es esterificado por los ésteres de fosfato descritos anteriormente. A partir de la dependencia del pH de la tasa de inactivación de la isomerasa de triosfato de levadura, se estima que el pKa aparente del grupo carboxilo de sitio activo es de 3,9 +/- 0,1. |
Inhibición de monoaniones y estudios de resonancia magnética nuclear 35Cl de la dipeptidasa renal. Se emplearon análisis cinéticos de la inhibición de monoaniones y la resonancia magnética nuclear 15Cl a 5,88 MHz para estudiar las interacciones de monoaniones con la enzima metalloenzima del zinc, la dipeptidasa renal. La hidrólisis catalizada por enzimas de la glicildehidrofenilalanina mostró inhibición competitiva cuando la tasa de reacción se determinó en la presencia de los aniones monovalentes fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, azido, nitrato o tiocanato o en la adición del anillo divalente, sulfato. La inhibición competitiva fue producida por estos aniones. Un anión estaba unido por molécula de enzima, y excepto en el caso del fluoruro, todos los aniones parecían unirse en el mismo lugar. El ión cianuro produjo una inhibición mucho más efectiva de la dipeptidasa renal que los otros monoaniones, y se demostró que dos iones cianuro estaban unidos por molécula de enzima. Una investigación del efecto del pH sobre la inhibición de monoaniones sugirió que los inhibidores de aniones se unen al grupo con un pK de aproximadamente 7,8. La disociación completa de este grupo (pH aproximado de 8,4) elimina el efecto inhibidor de los aniones. La ampliación de la línea 35Cl producida por la dipeptidasa renal en soluciones de 0,5 M de NaCl fue 100 veces más efectiva que la producida por concentraciones equivalentes de aquozínc(II). La expansión de la línea dependía de la concentración de la enzima metálica e independiente de la frecuencia de la radiación excitante. Cuando el ion de zinc se eliminó de la enzima metálica por diálisis o cuando el cloruro se tituló de la enzima metálica por cianuro, la expansión de la línea se disminuyó. El tratamiento de la dipeptidasa renal con concentraciones saturantes del inhibidor competitivo, el trifosfato de guanosina, en presencia de 0,5 M NaCl también produjo una disminución significativa en la anchura de la línea 35Cl. Se demostró que la ampliación de la línea 35Cl producida por la dipeptidasa renal disminuye con el aumento del pH a través del rango de pH de 5,8 a 10,8. Esta variación en la anchura de la línea con el pH parece ser el resultado de la titulación de un sitio en la metaloproteína con un pK aproximado de 7,4. Estudios de temperatura de la línea de ampliación de 35Cl por la enzima metallo en presencia de inhibidores de cloruro y cianuro sugieren que el proceso de intercambio rápido se refiere y que el mecanismo de relajación dominante es cuadrupolar en la naturaleza. |
La interacción de la superoxido dismutasa de eritrocitos bovinos con el peróxido de hidrógeno: inactivación de la enzima. La dismutasa de superóxido de eritrocitos bovinos se inactivó lentamente e irreversiblemente por el peróxido de hidrógeno. La tasa de esta inactivación dependía directamente de las concentraciones de H2O2 y de la enzima, y su tasa de segundo orden constante en pH 10.0 y 25 grados era de 6,7 M-1 sec-1. La inactivación fue precedida por un blanqueo debido a la rápida reducción de Cu2+ en la enzima, y después de esto hubo una reaparición gradual de una nueva absorción en la región visible, que coincidió con la pérdida de actividad catalítica. La inactivación de la enzima fue pH-dependiente e indicó una ionización esencial cuya pKa era de aproximadamente 10,2. La sustitución de H2O por D2O aumentó este pKa pero no disminuyó la actividad catalítica de la superoxida dismutasa, medida a pH 10.0. Varios compuestos, incluyendo xantina, urato, formato y ácido, protegen la enzima contra la inactivación por H2O2. Los alcoholes y el benzoato, que desprenden el radical hidroxilo, no protegen. Los compuestos con una afinidad especial para el oxígeno singlet fueron igualmente ineficaces. Los datos fueron interpretados en términos de la reducción de la enzima ligada Cu2+ a Cu+, por H2O2, seguido de una reacción de tipo de Fenton de Cu+ con H2O2 adicional. Esto generaría Cu2+-OH- o su equivalente ionizado, Cu2+-O--, que podría entonces atacar oxidativamente a una histidina adyacente e inactivar así la enzima. Los compuestos que protegían la enzima podrían haberlo hecho reaccionando con el oxidante vinculado, en competencia con la histidina adyacente. |
Estudios de dicroísmo circular y fluorescencia de anticuerpos homogéneos al tipo III de polisacárido pneumocócico. Se estudió el dicroísmo circular casi ultravioleta (CD) de tres anticuerpos homogéneos anti-tipo III pneumocócicos en la ausencia y la presencia del ligando hexasacárido específico. Además, se realizaron recombinaciones y híbridizaciones de las cadenas H y L derivadas de dos de estos anticuerpos y se midió el espectro CD de las moléculas IgG reconstituidas vinculadas y libres. Los resultados indican que los espectros CD de los anticuerpos nativos en el rango de 260-310 nm son muy similares en forma y signo y exhiben una banda positiva a 285 nm. Las moléculas homólogas reconstituidas de anticuerpos mostraron espectros de CD muy similares en forma y signo a los de las moléculas nativas de anticuerpos, aunque las moléculas recombinantes ya no se estabilizan por los enlaces de disulfuro interchain. Con la adición del ligando hexasacárido, se produjo una disminución significativa en la amplitud del espectro CD (18-21%) en los tres anticuerpos nativos y sus fragmentos Fab, así como en las moléculas recombinantes homólogas. No se pueden detectar cambios en el espectro de CD en la interacción del ligando hapto con los recombinantes heterológicos. Todos los anticuerpos homogéneos estudiados mostraron fluorescencia extinguida en la unión de oligosacáridos y un cambio azul del máximo de emisión. Esta propiedad permitió la determinación de la constante de unión de un anticuerpo seleccionado para ser hecho. Tomados juntos, los datos espectroscópicos de CD y fluorescencia sugieren que los ligandos de oligosacáridos inducen cambios conformativos detectables en el fragmento Fab del anticuerpo. |
Cambios conformacionales inducidos en un anticuerpo homogéneo anti-tipo III pneumocócico por oligosacáridos de creciente tamaño. La polarización circular de la luminescencia (CPL) emitida por los residuos de triptofano se utilizó como una sonda sensible para medir los cambios estructurales inducidos por ligando en un anticuerpo pneumocócico homogéneo tipo III. Se ensayó una serie de ligandos de oligosacáridos de tamaño creciente derivados de polisacáridos tipo III por hidrólisis parcial ácida. Se observaron cambios inducidos por ligandos en la polarización circular de la fluorescencia del anticuerpo para todos los antígenos probados, incluidos los tetra-, hexa-, y octasacáridos y un oligómero residual de 16, con los mayores cambios registrados en la interacción con el polisacárido neumocócico intacto tipo III (SIII). Cuando se utilizaron fragmentos de Fab' o F(ab')2 en lugar del anticuerpo IgG para la unión del polisacárido SIII, se redujo el grado de cambios conformacionales. Esto sugiere interacciones entre porciones Fab y Fc en la molécula IgG y cambios conformativos posteriores en la parte Fc en la unión del antígeno. La reducción de los enlaces de disulfuro entre cadenas abolió los cambios espectrales adicionales atribuidos a la parte Fc pero no los cambios observados en la parte Fab, lo que sugiere que la presencia del enlace de disulfuro entre cadenas en la región de la pendiente es necesaria para que ocurran los cambios máximos en la CPL. Los pequeños ligandos monovalentes, es decir, los tetra-, hexa-, y octasacáridos, eran capaces de inducir cambios en CPL en la parte Fab de la molécula del anticuerpo, así como cambios en CPL atribuidos a la parte Fc. Un ligando multivalente que contiene aproximadamente 16 residuos de azúcar parece ser el tamaño antigénico mínimo necesario para desencadenar los cambios de conformación atribuidos a la parte Fc, similares a los observados en la interacción con el antígeno polisacárido entero. |
Evidencia de la participación de una proteína ribosomal 50S en varios sitios activos. La función funcional de la proteína ribosomal B-L3 de Bacillus stearothermophilus 50S (probablemente homóloga a la proteína Escherichia coli L2) fue examinada por modificación química. El complejo [RNA B-L3-23S] fue fotooxidizado en presencia de rosebengal y la proteína modificada incorporada por reconstitución en subunidades ribosómicas 50S que contienen todos los demás componentes no modificados. Las partículas que contienen B-L3 fotooxidado son defectuosas en varios ensayos funcionales, incluyendo (1) la síntesis poli(U)-direccionada de poli(Phe), (2) la actividad de la peptidiltransferasa, (3) la capacidad de asociarse con un complejo [30S-poly(U)-Phe-tRNA] y (4) la unión del factor de alargamiento G y GTP. Las tasas de pérdida de las actividades funcionales parciales durante la fotooxidación de B-L3 indican que se producen al menos dos eventos de inactivación independientes, uno más rápido, que involucra la oxidación de uno o más residuos de histidina, afectando a las actividades de asociación de la peptidiltransferasa y subunidad y uno más lento que afecta a la unión de EF-G. Por lo tanto, la proteína B-L3 tiene uno o más residuos de histidina que son esenciales para la peptidiltransferasa y la asociación de subunidades, y otro residuo que es esencial para la unión de EF-G-GTP. B-L3 puede ser la proteína de la peptidiltransferasa ribosomal, o parte del sitio activo, y puede contribuir a los grupos funcionales a los otros sitios activos también. |
La interacción de la fosfolipasa A2 con las interfaces micelares. La función de la región N-terminal. La localización del sitio de reconocimiento de interfaz previamente postulado (IRS) en la fosfolipasa pancreática porcina A2, necesaria para una interacción específica entre la enzima y las interfaces lipídica-agua organizadas, se investigó mediante espectroscopia de diferencia ultravioleta, mediante mediciones de la fluorescencia intrínseca del residuo único de Trp, y mediante experimentos de protección contra la hidrólisis triptica específica. Usando los análogos de sustrato enzimicamente no degradables: CnH(2n+1)(0-)OOCH2CH2N+(CH3)3-(H,OH), se demuestra que la secuencia N-terminal bastante hidrofóbica de la enzima, es decir, Ala-Leu-Trp-Gln-Phe-Arg, está directamente involucrada en la interacción con la interfaz lipídica-agua. Además de la hidrofobia, probablemente también las interacciones polares contribuyan al proceso de vinculación. En pH neutro o ácido, la presencia de un puente de sal entre el grupo alfa-NH3+ N-terminal y una cadena lateral cargada negativamente estabiliza el sitio de reconocimiento de la interfaz y permite que la enzima penetre en las superficies micelares, incluso en ausencia de iones metálicos. En pH alcalino, la interacción de la enzima con las interfaces micelares requiere la presencia de iones Ca2+ (Ba2+). |
Fosfolipasa A2 como sonda de la distribución de fosfolipidos en las membranas eritrocitarias. Factores que influyen en la aparente especificidad de la reacción. Se investigó en detalle la acción de la fosfolipasa de veneno de serpiente A2 en eritrocitos humanos intactos. Se encontró que la fosfolipasa base de Agkistrodon halys blomhifii induce tanto la hidrólisis de los fosfolípidos de membrana como la hemólisis celular total bajo ciertas condiciones experimentales. Se encontró que la acción hidrolítica de la enzima básica consiste en dos eventos secuenciales: (a) la hidrólisis del 70% del pH celular total de la osphatidilcolina sin hemólisis aparente; y (b) la hidrólisis completa de la fosfatidilcolina restante, seguida estrechamente de la hidrólisis extensiva de la fosfatidiletanolamina y, finalmente, con el inicio de la hemólisis, el ataque a la fosfatidilserina. A pH 7.4 y 10 mM Ca2+ sólo ocurrió la fase (a). Sin embargo, una ligera elevación del pH de la incubación a un pH de 8,0 y/o la inclusión de 40 mM Ca2+ en la mezcla de reacción causó que ocurrieran ambos eventos (a) y (b). La adición de glucosa limitó la acción de la enzima a la etapa (a) en cualquier condición de reacción. Una investigación mostró que la hemólisis inducida por enzimas ocurrió en condiciones en las que los niveles de ATP intracelular se redujeron. Se presentan datos que sugieren que la etapa (b) es mediada por el flujo de Ca2+ a la célula cuando los niveles de ATP son bajos. Curiosamente, la fosflipasa del veneno de Naja naja (Pakistán) produjo resultados similares a los observados con la enzima básica del veneno de Agkistrodon. Sin embargo, la enzima de Crotalus adamanteus y la enzima ácida también presente en el veneno de Agkistrodon produjeron sólo ligera hidrólisis o hemólisis bajo cualquiera de las condiciones estudiadas. Otras especies de eritrocitos, por ejemplo, el cerdo guineano, el mono, el cerdo y el ratón, fueron probados, pero sólo los de cerdo guineano se comportaron de manera similar a las células humanas. Los eritrocitos de cerdo, mono y ratón se sometieron a hidrólisis y hemólisis muy limitadas. Es evidente que el uso de estas fosfolipases para sondar la localización de fosfolípidos en las membranas de los eritrocitos debe abordarse con precaución. Se discuten ciertas facetas de este problema. |
Interacciones de subunidad en la levadura gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. Se encontró que la inactivación espontánea de la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato de levadura se ajustaba a un modelo simple de dos estados a pH 8.5 y 25 grados. El primer paso es una disociación relativamente rápida del tetramer a dimers con el equilibrio en gran medida a favor del tetramer. En ausencia de NAD+, el dimer se inhabilita irreversiblemente. La apoenzima es bastante estable con una vida media para la pérdida completa de actividad proporcional a la raíz cuadrada de la concentración de la enzima. Las perturbaciones de la estructura de la proteína (por pH, fuerza iónica y sales específicas), que no tienen efecto en el estado tetramérico de la molécula, resultan en una alteración de la cooperatividad de la unión NAD+, la reactividad del grupo sulfhidrilo de sitio activo, y la actividad catalítica de la enzima. La modificación covalente de dos de los cuatro grupos sulfhidrilo de sitio activo tiene efectos profundos en la actividad enzimática que son mediados por cambios en las interacciones de las subunidades. Los estudios de análisis de sedimentación y de hibridización indican que la interacción entre las subunidades permanece fuerte después de la modificación covalente. En condiciones normales de diálisis fisiológica y de equilibrio, la proteína es un tetramero. Los estudios de diálisis de equilibrio de NAD+ que se une a la enzima a pH 8.5 y 25 grados revelan un patrón de cooperatividad mixta. Un modelo consistente con estas observaciones y la reactividad observada de la mitad de los sitios es el de los cambios de conformación secuenciales inducidos por ligando que se transmiten a través de dominios de subunidades que interactúan fuertemente. Se discuten métodos para distinguir patrones de unión cooperativos negativos de mezclas de enzimas desnaturalizadas y múltiples especies. |
Estudios de dispersión cinética de la luz sobre la disociación de la hemoglobina de Lumbricus terrestris. La cinética de la disociación inducida por el pH de la hemoglobina 3 X 10(6) mol de Lumbricus terrestris (el gusanillo de la tierra) se ha estudiado en un aparato de flujo paralizado que disipa la luz. Los datos de disociación dependiente de ligando se ajustaron bien por un modelo secuencial simple. Los datos para CO y oxihemoglobina son consistentes con Hb12 conduce a 2Hb6 conduce a 12Hb. La methemoglobina a pH 7 parece ser hexamérica y la disociación es consistente con el modelo: Hb6 conduce a 6Hb. En un esquema de descomposición secuencial para el cual se monitorean los cambios de dispersión de la luz, las cantidades relativas de la fase rápida y lenta se determinan por las constantes de velocidad, así como los pesos moleculares de las especies intermedias. La asignación del intermediario hexamérico se apoya por una investigación de la sensibilidad de las curvas cinéticas teóricas a los pesos moleculares de los intermediarios. Esta asignación se apoya aún más por lo siguiente: (1) el mismo modelo se ajusta a los datos para oxígeno y CO-hemoglobina en las tres temperaturas (una variación de 24 a 29 veces en las constantes de velocidad), (2) evidencia de la microscopía electrónica muestra formas hexaméricas, y (3) methemoglobina es aparentemente estable como un hexámetro en pH 7. Cuando el CO reemplaza al O2 como ligando, la tasa de disociación aumenta en un factor de cuatro. El met es aproximadamente 20 veces más rápido que la tasa de disociación inicial de la oxihemoglobina, pero quizás más relevante para comparar la disociación del hexámetro, la tasa de met fue 100 veces y 500 veces más rápida que la de las formas hexaméricas asumidas de CO- y oxihemoglobina. Las energías de activación para la disociación del dodecamer a hexámetro y para la disociación del hexámetro a formas más pequeñas fueron de aproximadamente 30 kcal/mol para oxígeno, CO, y methemoglobina. |
La reducción reversible de la metmioglobina de caballo por el complejo de hierro (II) de trans-1,2-diaminociclohexano-N,N,N,n-tetraacetato. Se ha investigado la reducción de metmioglobina por el complejo de hierro (II) de trans-1,2-diaminociclohexano-N,N,N'N'-tetraacetato (FeCDTA2-) La constante de equilibrio, medida espectroscópicamente, es de 0,21 con un potencial de reducción resultante de 0,050 V para Mb0. La constante de tasa para la reducción es 28 M-1 sec-1 con un deltaH ++ de 13 kcal M-1 y deltaS ++ de -11 eu. Tanto CN- como OH- inhiben la reducción debido a la relativamente baja reactividad de la cianometmioglobina (Mb+CN-) y la metmyglobina ionizada (Mb+OH-). La constante de tasa para la reducción de Mb+CN- por FeCDTA2- es 4.0 X 10(-2) M-1 sec-1 y que para la reducción de Mb+OH- es 4.8 M-1 sec-1. El complejo de óxido nítrico de metmioglobina se reduce con una constante de 10 M-1 sec-1. Se estudiaron las cinéticas de la oxidación de la oximoglobina por FeCDTA. Los datos son consistentes con un mecanismo en el que la oxidación se produce enteramente a través de la forma de la desoxia. Se calculó una constante de la tasa de 1.45 X 10(2) M-1 sec-1 para la oxidación de la deoximioglobina por FeCDTA-, en constante de equilibrio y constante para la tasa de reducción. Los datos anteriores se discuten en términos de una simple reacción de reducción de esfera exterior. |
Constitución y propiedades de las membranas axonales de los nervios del crustáceo. La purificación de las membranas axonales de los crustáceos fue seguida por la medición del enriquecimiento en la capacidad de unión de [3H]tetrodotoxina y en la actividad de Na+, K+-ATPase. Una característica de estas membranas es su alto contenido de lípidos y su bajo contenido de proteínas en comparación con otros tipos de membranas plasmáticas. La membrana axonal contiene proteínas similares a la miocina, similares a la actina, similares a la tropomyosina y similares a la tubulina. También contiene Na+, K+-ATPase y acetilcolinesterasa. Los pesos moleculares de estas dos enzimas después de la solubilización son 280,000 y 270,000, respectivamente. Los pesos moleculares de las subunidades catalizadoras son 96,000 para la ATPase y 71,000 para la acetilcolinesterasa. Hemos confirmado la presencia de un componente de unión de la nicotina en la membrana axonal del lobster, pero no hemos podido encontrar [3H] nicotina que se vincule a las membranas axonales del cangrejo. La unión a las membranas axonales og del canal de sodio, se ha estudiado en detalle. La constante de disociación para la unión de [3H]tetrodotoxina al receptor de membrana axonal es de 2,9 nM a pH 7,4. La concentración del receptor de la tetrodotoxina en las membranas del crustáceo es de aproximadamente 10 pmol/mg de proteína de la membrana, 7 veces menos que la acetilcolinesterasa, 30 veces menos que el Na+, K+-ATPase, y 30 veces menos que el componente de unión de la nicotina en la membrana del lobster. Una estimación razonable indica que aproximadamente sólo una cadena de péptidos en 1000 constituye la parte que une la tetrodotoxina del canal de sodio en la membrana axonal. La veratridina, que actúa selectivamente sobre la permeabilidad del sodio en reposo, se une a la parte fosfolipídica de la membrana axonal. [3H]La veratridina se une a las membranas paralelamente al efecto electrofisiológico. La veratridina y la tetrodotoxina tienen sitios de receptores diferentes. Aunque la tetrodotoxina puede repolarizar la membrana excitable de un axón gigante depolarizado por veratridina, la veratridina no afecta la unión de [3H]tetrodotoxina a las membranas axonales purificadas. Asimismo, la tetrodotoxina no afecta la unión de [3H]veratridina a las membranas axonales. La neurotoxina escorpión I, una toxina presináptica que afecta tanto a los canales Na+ como a los K+, no interfiere con la unión de [3H]tetrodotoxina o [3H]veratridina a las membranas axonales. Tetrodotoxina, veratridina y neurotoxina de escorpión I, que tienen en común la perturbación del funcionamiento normal del canal de sodio, actúan en tres tipos diferentes de sitios de receptores. |
Regulación de la fijación del nitrógeno. Mutantes de nitrogenasa deprimidos de Klebsiella pneumoniae. Se describe un nuevo procedimiento para la selección de mutantes deprimidos por nitrogenasa basados en el método de Brenchley et al. (Brenchley, J.E., Prival, M.J. y Magasanik, B. (1973) J. Biol. Chem. 248, 6122-6128) para aislar mutantes constitutivos de la histidasa de una bacteria no N2-fixante. Los niveles de nitrogenasa de los nuevos mutantes en presencia de NH4+ eran tan altos como el 100% de la actividad de nitrogenasa detectada en ausencia de NH4+. La caracterización bioquímica de estos mutantes de fijación de nitrógeno (nif) despresados revela que se clasifican en tres clases. Tres mutantes (estamas SK-24, 28 y 29), que requieren glutamato para el crecimiento, sintetizan nitrogenasa y glutamina sintetasa constitutivamente (en presencia de NH4+). Una segunda clase de mutantes (estamas SK-27 y 37) que requieren glutamina para el crecimiento produce niveles de actividad de nitrogenasa reprimidos y sintetiza la proteína cataliticamente inactiva de la glutamina sintetasa, como se determina inmunológicamente. Una tercera clase de mutantes que requieren glutamina, deprimidos por nitrogenasa (estaminas SK-25 y 26) no sintetiza ni una enzima cataliticamente activa de la glutamina sintetasa ni una proteína de la glutamina sintetasa inmunológicamente interreactiva. El análisis de la complementación F-prime revela que las cepas mutantes SK-25, 26, 27, 37 mapean en un segmento del cromosoma de Klebsiella que corresponde a la región codificante para la síntesis de glutamina. Dado que las cepas mutantes SK-27 y SK-37 producen la proteína de la glutamina sintetasa inactiva, se concluye que estas mutaciones mapean dentro del gen estructural de la glutamina sintetasa. |
La reacción entre el radical anión superóxido y el citocromo c. El radical anion superoxido (O2-) reacciona con el ferricitocromo c para formar el ferrocitocromo c. No se observan complejos intermedios. No se pudo detectar ninguna reacción entre O2 y ferrocitocromo c. A 20 grados C la constante de velocidad para la reacción a pH 4.7 a 6.7 es 1.4-10(6) M-1. S -1 y a medida que el pH aumenta por encima de 6,7, la constante de velocidad disminuye constantemente. La dependencia del pH es la misma para el corazón del atún y el citocromo c. No se pudo demostrar ninguna reacción entre O2- y la forma del citocromo c que existe por encima del pH de aproximadamente 9,2. La dependencia de la constante de la tasa en el pH se puede explicar si el citocromo c tiene pKs de 7.45 y 9.2, y O2- reacciona con la forma presente por debajo del pH 7.45 con k = 1.4-10(6) M-1 - S-1, la forma por encima del pH 7.45 con k = 3.0- 10(5) M-1 - S-1, y la forma presente por encima del pH 9.2 con k = 0.3. La reacción tiene una energía de activación de 20 kJ mol-1 y una entalpia de activación a 25 grados C de 18 kJ mol-1 tanto por encima como por debajo del pH de 7,45. Se sugiere que O2- puede reducir el citocromo c a través de una pista compuesta de aminoácidos aromáticos, y que es necesario un pequeño rearranjo de proteínas para la formación del complejo activado. No se puede demostrar la reducción del ferricitocromo c por los radicales de HO2 a pH 1.2-6.2, pero a pH 5.3, los radicales de HO2 oxidan el ferrocitocromo c con una constante de aproximadamente 5-10(5)-5-10(6) M-1 - S-1. |
Identificación de la fase mus 120 en la descomposición de la fluorescencia retardada en los cloroplastos de espinaca y las partículas subcloroplastas como la reacción de retroceso intrínseca. La dependencia del nivel de esta fase en el pH interno de los thylakoids. Después de un flash láser de 500 ratones, una fase de 120 ratones en la descomposición de la fluorescencia retardada es visible en una variedad de circunstancias en los cloroplastos de espinacas y las partículas de subcloroplastos enriquecidas en Photosystem II preparadas por medio de digitonina. El nivel de esta fase es alto en el caso de inhibición de la evolución del oxígeno en el lado donante de Photosystem II. Comparación con los resultados de Babcock y Sauer (1975) Bioquímica. Acta 376, 329-344, indica que su señal EPR IIf, que se supone que se debe a Z+, el primer donante secundario oxidado del Photosystem II, está bien correlacionado con una gran amplitud de nuestra fase de mus 120. Explicamos nuestra fase de los 120 ratones por la reacción de la espalda intrínseca del centro de reacción excitado en presencia de Z+, como lo predijo Van Gorkom y Donze (1973) Photochem. 17 y 333-342. El estado redox de Z+ depende del pH interno de los thylakoids. Los resultados sobre el efecto del pH en la región de los ratones se comparan con los obtenidos en la región ms. |
Cambios inducidos por la luz en la absorción y la resonancia de giro de electrones en pequeñas partículas del fotosistema II. Los componentes del centro de reacción del fotosistema II se han estudiado en pequeñas partículas del sistema II preparadas con digitonina. En la iluminación, la reducción del aceptor primario fue indicada por cambios de absorción debido a la reducción de una plastoquinona al anión de semiquinona y por un pequeño cambio azul de las bandas de absorción cerca de 545 nm (C550) y 685 nm. La proporción de semiquinona a clorofila estaba entre 1/20 y 1/70 en varias preparaciones. El donador de electrones terminales en esta reacción no causó grandes cambios de absorción, pero su forma oxidada fue revelada por una señal de resonancia de giro de electrones (ESR) hasta ahora desconocida, que tenía algunas propiedades de la bien conocida señal II, pero una anchura de línea y un valor g mucho más cercano a los de la señal I. Al oscurecerse la absorción y los cambios de ESR se descomponen juntos en una reacción cíclico o retroactivo que fue estimulado por 3-(3,4 diclorofenilo)-1,1-dimetilurato. El donante podría ser oxidado por ferricanida en la oscuridad. La iluminación en presencia de ferricanida indujo la absorción y los cambios en la ESR, rápidamente revertidos al oscurecerse, que pueden atribuirse a la oxidación de una clorofila un dimer, posiblemente el donador primario de electrones del fotosistema II. Además, se observó una señal de ESR con una anchura de línea de 15 a 20 gauss y una decadencia oscura más lenta, que puede haber sido causada por un donante secundario. |
Reacciones enzimáticas de hidroperóxidos de ácidos grasos en extractos de tubérculos de patata. Conversión de ácidos 9- y 13-hidroperoxi-octadecadienoicos a ácido monohidroxidienoico, derivados de ácido epoxyhydroxy y trihidroxymonoico. Los extractos crudos y las preparaciones de enzimas parcialmente purificadas de los tubérculos de la patata catalizan, a pH 5-7, la conversión de hidroperóxidos de ácido linoleico en una variedad de derivados de ácidos grasos oxigenados. Los isómeros de 9-D- y 13-L-hidroperóxido se convierten a tasas similares en productos equivalentes (isómeros). Los principales productos del isómero de 13-hidroperóxido se identificaron como el derivado correspondiente de ácido monohidroxidídico, ácido threo-11-hidroxi-trans12,13-epoxy-octadec-cis9-enoico y ácido 9,12,13-trihydroxy-octadec-trans10-enoico. Los productos correspondientes del 9-hidroperóxido fueron el ácido monohidroxydienoico, el ácido 9,10-epoxy-11-hydroxy-octadec-12-enoico y el ácido 9,10,13-trihydroxy-octadec-11-enoico. No se logró la separación de las actividades que forman los diferentes productos mediante la purificación parcial de los extractos de enzimas. La formación del producto no fue afectada por EDTA, CN-, reactivos de sulfidrilo o glutatión, pero fue reducida por la ebullición de los extractos. Este sistema se compara con la formación enzimática específica de 9-hidroperóxido de derivados de éter divinilo por extractos de patatas. |
Purificación parcial y propiedades de la fosfatidato microsomal fosfohidrolasa del hígado de ratas. La microsomal fosfatidato fosfohidrolasa (fosfatato EC 3.1.3.4) se solubilizó y se fraccionó para producir al menos dos fracciones enzimáticas activas distintas. Uno, denominado FA, era no específico, tenía un Km relativamente alto para el ácido fosfatídico y era insensible a la inhibición por diacylglycerol. La segunda fracción, FB, era específica para los fosfatidatos, tenía un Km bajo, y fue inhibida, no competitivamente, por el diacylglycerol. FA mostró una curva de actividad de substrato sigmoide. El FB aislado se agregó a partículas de aproximadamente 10(6) en ausencia de sales y podría ser disociado por la adición de cationes monovalentes a la fuerza iónica de 0,4-0,6 a aproximadamente 2-10(5) daltons y por lo tanto duplicó su actividad. La disociación era temporal y dependía de la temperatura. F – es inhibidor. Los iones divalentes no eran necesarios para la actividad de FA o FB y se inhibían a concentraciones superiores a 1 mM. |
Acerca de los átomos, XLVII. 12Hidroxilación alfa de precursores de ácidos biliares por microsomas de hígado de conejo. Los preparados microsómicos de hígado de conejo enriquecidos con 0,1 mM de NADPH promueven efectivamente la hidroxilación de [3beta-3H]- o [24-14C]alochenodeoxycholic ácido o [5alfa,6alfa-3H2]5alfa-colestano-3alfa,7alfa-diol a sus respectivos derivados 12alfa-hidroxyl en rendimientos de aproximadamente 25 o 65% en 60 min. Los requisitos para la actividad de la 12alpha-hidroxilasa microsomal del hígado de conejo son similares a los de los microsomas del hígado de ratas. De un número de inhibidores de las enzimas estudiadas, sólo el p-cloromercuribenzoato demostró una marcada capacidad para inhibir la reacción con el substrato tritiado. No hubo diferencia en la cantidad de producto producido a partir del ácido tritiado o el ácido etiquetado con 14C. No se encontró una clara diferencia de sexo en la actividad de la enzima, ni se observó una diferencia notable en la actividad de la enzima entre animales maduros e inmaduros. |
Purificación parcial y propiedades de una aldehido deshidrogenasa inducida por fenobarbital del hígado de ratas. Las propiedades de la deshidrogenasa citoplasmática de aldehído inducida por fenobarbital (EC 1.2.1.3) se han estudiado en el hígado de ratas. Se observaron niveles 7-12 veces mayores en las actividades citoplasmáticas después del tratamiento con fenobarbital en el reactor en comparación con los animales no reactores con altas concentraciones de acetaldehído (18 mM) y propionaldehído (9 mM). No se encontraron diferencias con 0,12 mM de acetaldehído, 2 mM de glicolaldehído, 6 mM de formaldehído o 0,5 mM de betaína aldehído. El grupo de reactores también tuvo una actividad ligeramente mayor en la fracción mitocondrial con las altas concentraciones de acetaldehído y propionaldehído. En la fracción microsomal, las actividades no mostraron diferencias en ninguna concentración de sustrato. Una aldehida deshidrogenasa inducida fue purificada 70 veces por técnicas cromatográficas. Tiene propiedades moleculares y enzimáticas diferentes a las de la principal enzima de alto Kilómetro que normalmente se encuentra en el citoplasma del hígado de ratas. El pI de la enzima inducida fue de aproximadamente 7,0 medida por el enfoque isoeléctrico. Fue activo con varios aldehídos alifáticos y aromáticos, pero no con formaldehído, glicolaldehído o D-gliceraldehído. Los valores de Km para el propionaldehído y el acetaldehído estaban en el rango millimolar. Las concentraciones millimolares de aldehídos aromáticos causaron una fuerte inhibición del substrato. La enzima fue inhibida por las concentraciones submicromolares de disulfiram. La estrona, la deoxicorticosterona, la progesterona y el diethylstilbestrol también afectaron la actividad de la enzima. |
Colinesterases de tejidos vegetales. Caracterización preliminar de las enzimas de Solanum melongena L. y Zea mays L. Las enzimas capaces de hidrolizar los ésteres de tiocolina se han ensayado en extractos de Solanum melongena L. (planta de huevo) y Zea Mays L. (cordero). Las enzimas de ambas especies son inhibidas por las anti-colinesterases neostigmina, fisostigmina, y 284c51 y por AMO-1618, un retardante del crecimiento de las plantas y ambos tienen pH óptima cerca de pH 8,0. La enzima de la planta de huevo es máxima activa a una concentración de substrato de 0,15 mM de acetiltiocolina y se inhibe a concentraciones de substrato más altas. Sobre la base de esta última propiedad, la magnitud de la inhibición por los diversos inhibidores, y la especificidad del sustrato, concluimos que la enzima de la planta de huevo, pero no la del maíz, es una colinesterasa. |
Comportamiento de la fosfatasa ácida soluble e inmovilizada en los medios hidroorgánicos. Se ha investigado la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato por la fosfatasa de ácido germinal de trigo (fosfohidrolasa monoestérico ortofosfórica, EC 3.1.3.2) en mezclas de tampones acuosos con acetona, dioxano y acetonitrilo. La enzima estaba en solución libre o inmovilizada en un soporte pellicular que consistía en una capa carbonacea porosa en perlas de vidrio sólido. La mayor actividad enzimática se obtuvo en acetona y acetonitrilo mezclados con buffer de citrato en un amplio rango de concentraciones de disolventes orgánicos. En el 50% (v/v) de la acetona, tanto el V como el Km de la enzima inmovilizada eran aproximadamente la mitad de los valores en el buffer acuoso limpio, pero el Ki para el fosfato inorgánico no cambió. En las mezclas del 50% (v/v) de varios disolventes y tampones de citrato de diferentes pH, se encontró que la actividad enzimática depende del pH del componente tampón acuoso en lugar del pH de la mezcla hidroorgánica medida con el electrodo de vidrio-calomel. Las tasas relativamente altas de liberación de p-nitrofenol en presencia de glucosa incluso a altas concentraciones de disolventes orgánicos sugieren que la transfosforilación se facilita a baja actividad del agua. |
Purificación y algunas propiedades enzimáticas de la quitosanasa de Bacillus R-4 que lisa las paredes celulares de Rhizopus. Una cepa de Bacillus sp (Bacillus R-4) produce una proteasa y una carbohidrolasa, ambas de las cuales tienen la capacidad de iluminar las paredes celulares de Rhizopus. De las enzimas, la carbohidrolasa ha sido purificada a un estado ultracentrifugalmente y electroforéticamente homogéneo, y identificada como una quitosanasa. La enzima fue activa en el glicol chitosan así como en el chitosan. El peso molecular de la enzima purificada se estimó en 31 000 y el punto isoeléctrico en pH 8,30. La enzima fue más activa a pH 5,6 y a 40 grados C con la pared celular de Rhizopus o el glicol quitosano como sustrato, y fue estable en un rango de pH de 4,5 a 7,5 a 40 grados C durante 3 h. La actividad fue perdida por los reactivos de sulfhidrilo y restaurada por el glutatión reducido de L-cisteína. Una brusca disminución en la viscosidad de la mezcla de reacción sugirió una división endócrina de quitosano por esta enzima. |
Estudios de especificidad de las alfa-mannosidases utilizando oligosacáridos de la orina de la manosidosis como sustratos. Los oligosacáridos que contienen residuos de alfa (1 conduce a 2)-, alfa(1 conduce a 3)-, y alfa(1 conduce a 6)-enllazados de manosa, aislados de la orina de la manosidosis humana y bovina, se utilizaron como sustratos para probar las especificidades de las alfa-mannosidases ácidas aisladas del hígado humano y bovino. Las enzimas liberaron todos los residuos de manosa alfa-ligados de cada oligosacárido y fueron más eficaces en el substrato más pequeño. La enzima A en cada caso fue menos activa en los oligosacáridos que la alfa-mannosidasa B2, aunque el valor Km aparente para los sustratos era el mismo con cada enzima. También se encontró que las alfa-mannosidases ácidas humanas son más activas en los sustratos aislados de la orina humana en lugar de la manosidosis bovina. La alfa-mannosidasa humana C, que tiene un pH neutro óptimo cuando se ensayó con un substrato sintético, no hidrolizó ninguno de los oligosacáridos a pH neutro, pero se encontró que era activo a un pH ácido. |
Adenosina trifosfatasa estimulada por calcio en la fracción microsomal del germen dental del feto de cerdo. Se ha informado de la caracterización y localización de una Ca(2+)-ATPase (ATP fosfohidrolasa, EC 3.6.1.3) en el germen dental del feto de cerdo. Esta enzima, una fracción microsómica, es activada preferentemente por Ca(2+). En presencia de 0,5 mM de ATP, la actividad enzimática máxima se obtiene a 0,5--1,0 mM de CaCl2. La tasa máxima de hidrólisis de ATP es de aproximadamente 20 mumol por hora por mg de proteína como la preparación enzimática se utiliza aquí. A una concentración óptima de Ca(2+), la Mg(2+) tiene un efecto inhibidor. La enzima no requiere Na+ y/o K+ para la activación por Ca(2+). Otros trifosfatos de nucleótidos pueden servir como el substrato, pero V para ATP es el más alto. El Km para ATP es de 8,85 - 10(-5) M. El pH óptimo para la activación de la enzima Ca(2+) se encuentra en torno a 9,2. Los inhibidores bien conocidos de (Na+ + K+)-ATPase, mitocondria ATPase y Ca(2+)-ATPase en el eritrocito no inhiben la enzima. En el orden subcelular, se puede asumir que la enzima se localiza en la fracción del retículo endoplasmático liso que contiene fragmentos de membrana celular y del cuerpo de Golgi y en el orden de tejido en el órgano esmalte que contiene una capa de ameloblastos, el stratum intermedium y el retículo estelar. |
Preparación y caracterización de un derivado inmovilizado enzimáticamente activo de la miosina. La miosina muscular esquelética purificada (EC 3.6.1.3) ha sido covalentemente unida a la Separosa 4B por el procedimiento de bromuro de cianógeno. El complejo resultante, Sepharose-Myosin, posee la actividad de la adenosina trifosfatasa y es relativamente estable durante largos períodos de tiempo. En condiciones óptimas de unión, se conserva aproximadamente el 33% de la actividad ATPase específica de la miosina vinculada. La electroforesis del gel de poliacrilamida de los polipéptidos liberados de la Sepharose-Myosin desnaturalizada indica que el 85% de la miosina se adhiere a las perlas de agarosa a través de las cadenas pesadas y el resto a través de las cadenas ligeras, de acuerdo con las predicciones de unión y liberación basadas en el contenido de lisina o los pesos moleculares de las subunidades de themyosina. La adenosina trifosfatasa de la miosina inmovilizada ha sido investigada bajo condiciones de pH variable, fuerza iónica y concentración de catión. Los perfiles de ATPase de la miosina inmobilizada son bastante similares a los de la miosina libre, sin embargo se encuentran diferencias sutiles. La Sepharose-Myosin ATPase no es tan sensible como la miosina a alteraciones en la concentración de sal y la KM aparente es aproximadamente dos veces mayor que la de la miosina. Estas diferencias se deben probablemente a la modificación química en la región del lugar (s) de adhesión a las perlas de agarosa y a las limitaciones de hidratación y difusión impuestas por la matriz de agarosa polimérica. |
Etiquetado radioactivo y localización de grupos tiol específicos en la miosina de los músculos rápidos, lentos y cardíacos. Basándose en la incorporación de N-ethylmaleimide etiquetado radioactivamente, los grupos tiol fácilmente reactivos de miosina aislada (EC 3.6.1.3) de los músculos rápidos, lentos y cardíacos podrían clasificarse en 3 tipos. Todas las 3 miosinas contienen 2 thiol-1, 2 thiol-2 y un número variable de grupos thiol-3 por molécula. Tanto los grupos thiol-1 como thiol-2, que son esenciales para el funcionamiento de la ATPase estimulada por K+, se encuentran en las cadenas pesadas de los 3 tipos de miosina. La variación en el patrón de incorporación de N-ethylmaleimide sobre las 3 clases de grupo thiol en condiciones de estado estacionario de Mg(2+) - hidrólisis de ATP permitió diferentes conformaciones de algunos intermedios de reacción para ser caracterizado. En todos los 3 tipos de miosina se encontró que el ciclo hidrolítico de Mg(2+) - ATP se controla por el mismo paso a 25 grados C. En los tres casos, este paso de limitación de la tasa se modifica de la misma manera por la baja de la temperatura. Usando los pesos moleculares quimicamente determinados para las cadenas ligeras de miosina, se encontró que su stoichiometría basada en la electroforesis del sulfato de dodecilo de sodio es de 1.2 : 2.1 : 0.8 para la cadena ligera-1: cadena ligera-2: cadena ligera-3 por molécula de miosina rápida, 2.0 : 1.9 para la cadena ligera-1: cadena ligera-2 por molécula de miosina lenta y 1.9 : 1.9 para la cadena ligera-1: cadena ligera-2 por molécula de miosina cardíaca. Esta diferencia cualitativa en la composición de la subunidad ligera entre los dos tipos de miosina rápida y lenta no se refleja en las pequeñas variaciones de las características expuestas por las miosinas aisladas, sino que más bien parece estar relacionado con sus respectivas actividades de ATPase myofibrilar. |
Reducción de la glutatión. Estudios de la cinética y estabilidad de la enzima como función del pH y la concentración de sal. Las dependencias del pH de la constante Michaelis aparente para el glutatión oxidado y el número aparente de volumen de la glutatión redutasa de levadura (EC 1.6.4.2) se han determinado a una concentración fija de 0,1 mM de NADPH en el rango de pH de 4,5 - 8,0. Entre el pH de 5,5 y 7,6, ambos parámetros son relativamente constantes. El efecto principal del pH bajo en la cinética de la reacción catalizada por la enzima es la observación de una inhibición del substrato dependiente del pH por glutatión oxidado a un pH inferior o igual a 7, que se muestra correlacionar con la unión del glutatión oxidado a la forma oxidada de la enzima. La actividad catalitica de la glutatión redutasa en la levadura a un pH de 5,5 es afectada por la concentración de tampón de acetato de sodio. La estabilidad de las formas oxidadas y reducidas de la enzima a pH 5.5 y 25 grados C en ausencia de albumina sérica bovina se estudió como una función de la concentración de acetato de sodio. Los resultados muestran que la activación de la actividad catalítica de la enzima a baja concentración de acetato de sodio se correlaciona con el efecto del acetato de sodio en una forma reducida de la enzima. Por el contrario, la inhibición de la actividad catalítica de la enzima en concentraciones altas de acetato de sodio se correlaciona con el efecto del acetato de sodio en la forma oxidada de la enzima. |
Características de la forma desfosforilada de la fosforilasa purificada de hígado de ratón y medición de su actividad en preparados de hígado crudo. La forma fosforilada de la fosforilasa glicogénica hepática (alfa-1,4-glucan: orthophosphate alfa-glucosyl-transferase, EC 2.4.1.1) (fosforilasa a) es activa y fácilmente medible, mientras que la forma desfosforilada (fosforilasa b), a diferencia de la enzima muscular, se ha reportado que es esencialmente inactiva incluso en presencia de AMP. Purificamos ambas formas de fosforilasa del hígado de ratas y estudiamos las características de cada una. La actividad de la fosforilasa b se puede medir con nuestras condiciones de ensayo. La fosforilasa b que obtuvimos fue estimulada por altas concentraciones de sulfato, y era un substrato para la fosforilasa kinasa muscular mientras que la fosforilasa a fue inhibida por el sulfato, y era un substrato para la fosforilasa hepática. La unión del substrato a la fosforilasa b fue pobre (KM glicógeno = 2,5 mM, glucosa-1-P = 250 mM) en comparación con la fosforilasa a (KM glicógeno = 1,8 mM, KM glucosa-1-P = 0,7 mM). La fosforilasa b del hígado era activa en ausencia de AMP. Sin embargo, AMP redujo el KM para la glucosa-1-P a 80 mM para la fosforilasa purificada b y a 60 mM para la enzima en extracto crudo (Ka = 0,5 mM). Utilizando las concentraciones adecuadas de substrato, tampón y AMP, se han desarrollado condiciones de ensayo que permiten la determinación de la fosforilasa a y el 90% de la actividad de la fosforilasa b en los extractos hepáticos. La interconversión de las dos formas se puede demostrar in vivo (bajo estimulación aguda) e in vitro con poco cambio en la actividad total. Se ha observado una disminución de la actividad total de la fosforilasa después de la hambruna prolongada y en la diabetes. |
Múltiples formas de caseína quinasa de eritrocitos de conejo. Dos chinazas de caseína de eritrocitos de conejo, GTP:caseína quinasa I y GTP:caseína quinasa II, han sido purificadas 29 000- y 47 000 veces, respectivamente. Los estudios que utilizan la centrifugación gradiente de densidad de sacarosa indican que la quinasa I tiene un peso molecular de aproximadamente 9.5 - 10(5) (25 S) y la quinasa II de aproximadamente 1.4 - 10(6) (32 S). Estas enzimas pueden utilizar ATP o GTP como donante de fosforilo. Entre los diversos sustitutos de proteínas examinados, estas kinases catalizan la fosforilación de la caseína mayor que la fosvitina desfosforilada 50% congruente a la caseína desfosforilada 50% mayor que la fosvitina. Histones, protamina y albumina de suero bovino son aceptores de fosforilo pobres. Los datos cinéticos indican que ambas enzimas son inhibidas por altas concentraciones de substrato de caseína que pueden ser parcialmente aliviadas por NaCl. Ambas fosfotransferases requieren Mg(2+) para la actividad y son óptimamente activas a pH 9.0. Las enzimas tienen valores Km aparentes de 2.5 - 10(-5) M para GTP, 2 - 10(-5) M para ATP, y 0,4--0,6 mg/ml para la caseína. La incorporación del fosfato terminal de GTP a la caseína como catalizada por estas enzimas es inhibida en diferentes grados por ATP, ITP, ADP y GDP pero no por UTP, CTP, GMP, adenosina 3':5'-monofosfato cíclico y guanosina 3':5'-monofosfato cíclico. Además, se ha encontrado que el NaF y el ácido 2,3-difosfoglicérico inhiben la actividad de ambas kinases. El efecto del 2,3-difosfoglicerato es interesante y sugiere que este metabolito puede regular la actividad de las kinases de la caseína en los glóbulos rojos. |
Estudios cinéticos y efectos de los aniones en la creatina fosfokinasa del músculo esquelético del mono rhesus (Macaca mulatta). Un procedimiento de purificación para la creatina kinasa (EC 2.7.3.2) del músculo del mono35-170 muequiv H+ / mg de proteína por minuto a 30 grados C y un rendimiento de aproximadamente 0,5 g / kg de músculo. Asumiendo la cinética del equilibrio, se encuentra la unión sinérgica de los sustratos en un sitio catalizador para las reacciones delantera y delantera. Se determinan las constantes cinéticas para la unión de cada sustrato a la enzima libre y al complejo de segundo sustrato de la enzima y se comparan con las de la enzima de otras especies. La inhibición por aniones pequeños se determina en la presencia de diferentes combinaciones de sustitutos y productos. SO4(2-) inhibe por simple inhibición competitiva y probablemente se une en el sitio del grupo fosfórico transferible. La inhibición por NO3-, NO2-, SCN- y Cl- es más compleja y se sugiere que estos iones imiten el grupo fosfórico transferible en un complejo de estado de transición plano. Estos aniones estabilizan el complejo muerto, la enzima-creatina-MgADP, que carece del grupo fosfórico transferible. Los efectos de estos aniones en las constantes de disociación de los complejos de enzima-substrato se reportan y están de acuerdo con la hipótesis anterior. El complejo muerto en ausencia de aniones no protege al grupo tiol esencial contra la inhibición por la iodoacetamida. La adición de NO3- o Cl- al complejo de acabado muerto o a una mezcla de equilibrio de sustrato sin aniones proporciona protección. El grupo tiol esencial es inhibido por la iodoacetamida a una velocidad que es esencialmente independiente del pH por encima del rango normal de estabilidad de la enzima. Contrariamente a nuestro informe anterior, esta independencia del pH no se altera por la presencia de complejo de finos, creatina más MgADP, en la presencia o ausencia de aniones o en la presencia de una mezcla de equilibrio de sustrato. Se deduce que el grupo thiol "esencial" de la enzima del mono tiene esencialmente las mismas propiedades que la de la enzima del conejo. En consecuencia, las inferencias hechas sobre el papel de este grupo basado en nuestro trabajo anterior sobre la enzima mono ya no son válidas. Los hallazgos presentados son compatibles con el grupo tiol esencial que desempeña un papel de conformacin en el proceso catalítico. |
Estudios sobre células corticales renales de ratón kallikrein. I. Separación y medición. Se ha desarrollado una técnica para separar y medir el kallikrein en una población heterogénea de células corticales renales de ratón en suspensión. Después de que los riñones de ratas fueron perfusionados in situ en ratas anestesiadas, se obtuvieron suspensión de células corticales viables y contadas. Las células fueron suspendidas en un buffer de sacarosa/Tris que contenía un 0,5% de desoxicolato, homogeneizado, centrifugado, dializado y gel filtrado en Sephadex G-25. La cromatografía de columna en la DEAE-celulosa resultó en un único pico de actividad de la esterasa entre 0,20 y 0,25 M NaCl / buffer de fosfato de sodio. La elución posterior produjo una esterasa alcalina que era idéntica a la kallikrein aislada de la orina de ratas, en lo que respecta al pH óptimo, los efectos de los inhibidores, la actividad bioanalítica y las propiedades inmunológicas. Los rendimientos calculados fueron de aproximadamente el 70% de la actividad total de la esterasa presente en los homogenatos de las células madre. La recuperación de un kallikrein urinario purificado de ratón agregado a los homogenatos celulares, las columnas de celulosa DEAE, o los eluates de las columnas variaron de 83-108% (medio 96%). Usando esta técnica, se encontró que la cantidad de actividad de kallikrein presente en las células corticales renales no incubadas varía de 0,6-10(-2) a 4,6-10(-2) alfa-N-tosil-L-arginina ester metil (Tos-Arg-OMe) unidades de esterasa por 10(8) células. Sin embargo, las células incubadas en un medio de nutrientes a 37 grados C durante 3-8 horas no contenían actividad de kallikrein mensurable, mientras que el medio circundante tenía actividad de kallikrein que podría ser significativamente aumentada por aldosterona y disminuida por spironolactona. |
Estudios sobre la transferencia de electrones entre el electrodo de mercurio y la hemoproteína. El comportamiento electroquímico del ferricitocromo c, metmioglobina y methemoglobina se estudió utilizando d.c., a.c. y polarografía de pulso diferencial, y la electrolisis de potencial controlada. Las tres hemoproteínas producen d.c. pasos polarográficos, y picos en polarogramas de pulso diferencial, cuya altura es proporcional a la concentración. La transferencia de carga está influenciada por una fuerte adsorción.2. La dependencia de concentración de los polarogramas a.c. indica cambios estructurales en las moléculas adsorbidas. Los productos de reducción de la electrolisis de potencial controlado de metmioglobina y methemoglobina tienen espectros de absorción idénticos a los de las muestras de control nativas. La afinidad para el oxígeno y la cooperatividad en la hemoglobina no están afectadas por la reacción en el electrodo. La transferencia de carga procede a través de moléculas adsorbidas, ya reducidas, a proteínas libremente difusibles. |
La unión de los fosfatos orgánicos a la metahemoglobina humana A. Perturbación de la polimerización de las proteínas por efectores. Se presenta una teoría relacionada con la unión de un efector a dos estados de un aceptor de proteínas que coexisten en equilibrio. El problema se trata en términos de los cuatro casos posibles que especifican relaciones entre el número de sitios de unión y las constantes de unión intrínsecas relevantes para los estados de aceptor. Se demuestra que una distinción entre estos casos puede ser posible en base a la forma de un plano de concentración de efector ilimitado versus el coeficiente de equilibrio constitutivo que se puede calcular a partir del coeficiente de sedimentación del constituyente de la proteína. Particularmente notable en este sentido es el hallazgo de que un punto de inflexión puede existir en esta trama para condiciones definidas con sistemas en los que los sitios de unión no se conservan (y las afinidades de unión se alteran) en la formación de polímeros. El último tipo de sistema es ejemplificado por estudios de metahemoglobina A en 0,25 M de acetato de sodio, pH 5,4. En ausencia de efectores de fosfato orgánico añadido, un equilibrio dimer-tetramer funciona regido por una constante de asociación de 4,15 +/- 0,06 X 10(3) 1/mol, determinado a partir de los resultados del equilibrio de sedimentación. La correlación entre la velocidad de sedimentación y los resultados de equilibrio muestra que la adición de adenosina 5'-trifosfato (ATP) resulta en su unión a un sitio en cada una de las especies diméricas (alfa beta) y tetramericas (alfa beta)2 con constantes de unión intrínsecas de 1.03-10(3)-1.20-10(3) y 1.1-10(4)-2.1-10(4) 1/mol, respectivamente. También se ha demostrado que el 2,3-difosfoglicerato perturba el equilibrio dimer-tetramer de una manera similar al ATP. |
Estudios de etiqueta de spin N-terminal de hemoglobina, ligando y dependencia del pH. La hemoglobina humana fue rotulada con 4-isothiocanato-2,2,6,6-tetramethyl-piperdinooxyl, que se sabe que se une específicamente a los grupos alfa-amino N-terminales de proteínas y ligeramente a los grupos sulfhidryl reactivos. El análisis de resonancia de spin de electrones (ESR) indicó un espectro de cinco líneas parcialmente resuelto, lo que sugiere que la etiqueta estaba unida a al menos dos sitios de unión diferentes. Usando reactivos de bloqueo específicos antes de la rotulación de spin, los dos sitios de unión se atribuyeron al grupo sulfhidrilo de beta-93 (inmóvil) y al grupo alfa-amino de las valinas N-terminales (móvil). El movimiento relativo del spin en un conjunto de sitios de unión fue restringido independientemente del estado de ligación y pH, mientras que el movimiento en el otro sitio mostró dependencia de esos parámetros, por ejemplo, las extremidades N-terminales de la deoxihemoglobina con etiqueta de spin tienen movimiento restringido en todos los rangos de pH estudiados, mientras que los de la oxihemoglobina son relativamente libres de moverse en el rango de pH básico, pero se vuelven más restringidos en el rango de pH ácido. |
El comportamiento de las formas holo y apo de la superoxida dismutasa bovina a un pH bajo. Se ha demostrado que la holo-superoxido dismutasa de eritrocitos bovinos se somete a una modificación estructural reversible en el rango de pH de 3 a 5. Las alteraciones espectrales observadas en el cambio de la neutralidad al pH 2 fueron: una leve atenuación de la absorción de 680 nm; la pérdida del hombro de 450 nm, aparente en el espectro óptico de la proteína nativa; y una nueva banda apareció a 330 nm. El dicroísmo circular en 600 nm fue esencialmente perdido mientras que una banda negativa débil apareció en aproximadamente 380 nm y una banda positiva en 310 nm. El espectro de EPR también se modificó al cambiar de la forma nativa a la forma de pH bajo: A paralelo aumentó de aproximadamente 130 a aproximadamente 150 G, g paralelo permaneció inalterado en aproximadamente 2.27, y gm disminuyó de aproximadamente 2.09 a aproximadamente 2.08. El ancho de línea aparente permaneció esencialmente constante.4. Los espectros PMR de alta resolución (220 MHz) de holo- y apoproteínas revelaron que los metales influyen en la estructura tridimensional de la proteína. Los estudios de PMR indicaron que en el pH 3 la apoproteína existía casi enteramente en forma de bobina aleatoria y que asumió una estructura compacta bien ordenada al regresar al pH neutro. La holoproteína mantuvo una estructura compacta, aparentemente dimérica, incluso a pH 3. |
precipitación mecánica de la hemoglobina. Hb Köln (beta 98 Val conduce a Met) se encontró a precipitar rápidamente durante el temblor mecánico. La tasa de precipitación de Hb Köln es 5-6 veces más rápida que la de Hb S. La cinética de precipitación del hemólito del paciente, que es una mezcla de Hb Köln y Hb A, mostró una curva bifásica que indica que Hb Köln precipita independientemente de Hb A. La inestabilidad de Hb Köln puede atribuirse al cambio conformativo en la cercanía del heme. El temblor mecánico puede utilizarse como un nuevo método para la detección y la cuantificación de la hemoglobina Köln y otras hemoglobinas inestables. |
Propiedades físicas y subunidades de Haemopis grandis erythrocruorin. El eritrocruorin del lech Haemopis grandis poseía un S20,w de 57 S a pH neutro, su punto isoeléctrico a pH 6,0 y exhibía una curva de oxigenacin ligeramente sigmoida con n aproximadamente 2,1 y P50 = 11,2 mm a pH 7,4. Se determinó un peso molecular mínimo de 24000 +/- 1500 por grupo heme a partir del contenido de hierro y heme, 0,22 +/- 0,01 y 2,73 +/- 0,14 % en peso, respectivamente. La composición de la subunidad del eritrocruorino se investigó utilizando la filtración de gel en dodecil sulfato de sodio y la electroforesis de gel de poliacrilamida en dodecil sulfato de sodio a pH neutro. Haemopis erythrocruorin disociado en presencia de sodio dodecyl sulfato en cuatro subunidades (1 a 4) que poseen pesos moleculares de aproximadamente 27000, 23000, 21000 y 13500, respectivamente. Cuando la eritrocruorina se redujo con mercaptoetanol antes de la electroforesis del dodecilo sulfato de sodio, se observaron tres subunidades, que poseen pesos moleculares de aproximadamente 13000 (I), 16500 (II) y 28000 (III). La electroforesis del dodecil sulfato de sodio de las subunidades aisladas 1 a 4 mostró que la subunidad I fue proporcionada por las subunidades 1 y 4, la subunidad II fue proporcionada por la subunidad 1 y la subunidad III fue proporcionada por ambas subunidades 2 y 3. Haemopis erythrocruorin, por lo tanto, parecía consistir en al menos cinco cadenas de polipéptidos diferentes. Es probable que no todas las cadenas de polipéptidos constituyentes estuvieran asociadas cada una con un grupo heme. La forma del Haemopis erythrocruorin observada por microscopía electrónica parecía ser consistente con la array hexagonal de dos capas característica de las eritrocruorinas annelidas y las clorocruorinas. |
Miosina del músculo liso arterial: aislamiento después de la depolimerización de la actina. Las proteínas contractibles del músculo liso arterial son altamente solubles, y se pueden extraer en I = 0.05. Sin embargo, pueden ser precipitados por una diálisis prolongada a pH 6 para dar una actomyosina con una alta, aunque variable, relación actina-miosina. El comportamiento de sedimentación de esta actomyosina a alta resistencia iónica se examinó como una función del pH, la concentración de proteínas y la composición mediante la ultracentrifugación preparatoria. Las comparaciones con actomyosinas musculares esqueléticas sintéticas de composición similar demostraron diferencias significativas en los comportamientos de estos dos sistemas. Se encontró que la actomyosina de músculo liso no es disociada por condiciones de relajación normal, y que se sedimenta a una tasa más lenta que la F-actina. La solubilidad de la proteína supernatante (una actomyosina enriquecida con miosina) en 0,2 M K Cl (pH 7) dependía del pH durante la centrifugación. Una menor solubilidad se asoció sólo con una mayor concentración de actina en el supernatante, lo que sugiere una dependencia de la repolimerización de la actina. La miosina pura se precipitó selectivamente del supernatante por el polietileno glicol-6000, pero sólo cuando la proteína era soluble a baja fuerza iónica. La solubilidad de la miosina purificada era similar a la de la miosina de los músculos estriados. Se sugiere una relación entre la presencia de actina depolimerizada y la alta solubilidad de las proteínas contráctiles del músculo liso. |
Híbridos de derivados químicos de la fosfatasa alcalina de Escherichia coli. Se han investigado las actividades de los dimeros híbridos de la fosfatasa alcalina que contienen dos subunidades modificadas químicamente. Una especie híbrida se preparó por disociación y reconstitución de una mezcla de dos variantes producidas por modificación química de la enzima nativa con anhídrido succínico y tetranitrometano, respectivamente. El híbrido succinil-nitrotyrosil se separó de los otros miembros del híbrido establecido por la cromatografía DEAE-Sephadex y luego se convirtió en un híbrido succinil-aminotyrosil por la reducción de los residuos de tirosina modificados con dithionita de sodio. Una comparación de las actividades de estos dos híbridos con las actividades de los derivados succinilo, nitrotiroxil y aminotiroxil ha demostrado que o bien las subunidades de fosfatasa alcalina funcionan de forma independiente o si las subunidades circulan alternadamente en un mecanismo recíproco, entonces la actividad intrínseca de cada subunidad debe depender fuertemente de su subunidad compañera. |
Algunas propiedades físico-químicas de la hemoglobina-manitoba (alfa2 102Ser reemplazado por Arg (G9) beta2). Hb-Manitoba fue descubierto en 1970 [1] en una familia canadiense de origen británico. Recientemente observamos la misma variante en una segunda familia, y encontramos que el derivado de oxígeno de Hb-Manitoba es ligeramente inestable a 65 grados C, disocia menos fácilmente a pH alcalino que Hb-A, y forma híbridos asimétricos con otras hemoglobinas que son fácilmente detectables por electroforesis. |
La afinidad de oxígeno de la hemoglobina Tak, una variante con una cadena beta alargada. Se investigó la afinidad de oxígeno de Hb Tak purificado, una variante de la hemoglobina humana con cadenas beta alargadas. Se encontró un valor muy bajo de P50 que no fue influenciado por la adición de 2,3 difosfoglicerato. El valor n fue 1, indicando no cooperatividad. La curva de equilibrio de oxígeno de todo el hemólito de la sangre que contiene Hbs A y Tak estaba cerca de la de Hb A en la parte superior de la curva, mientras que la parte inferior de la curva se desviaba mucho de la última, indicando una interacción pequeña si alguna entre Hb A y Tak durante la oxigenación. |
Efectos de la ribonucleasa de membrana y la 3'-nucleotidasa en la digestión del ácido poliuridílico por la membrana plasmática del hígado de ratas. Los fragmentos de la membrana plasmática del hígado de ratón aislado poseen una actividad ribonucleasa que, a un pH de 7,8 en presencia de 10 mM EDTA, puede digerir el ácido poliuridílico (poly(U)) y el ácido policitídico (poly(C)) pero no el ácido poliadenílico (poly(A)) y el ácido policuanílico (poly(G)). En estas condiciones, la preparación de membrana no degrada el ADN nativo o denaturado. Los productos de la reacción con poli(U) (10 mM de EDTA presente) se pueden separar en DEAE-Sephadex en oligonucleótidos de aumento de la longitud de la cadena. La mayoría de los productos son di- a hexa-nucleótidos que contienen grupos terminales 3'-fosfato. Cuando EDTA no está presente (pH 7,8 o 8,8) la preparación de la membrana plasmática degrada tanto a poli(A) como a poli(U). Con el poli(A) el producto es todo nucleósido mientras que con el poli(U) como substrato la mayor parte del producto es nucleósido, pero también se producen algunos oligonucleótidos. La ribonucleasa libera productos solubles en ácido muy lentamente de altas concentraciones de poli(U) (mg/ml). El trinucleótido de uridina con y sin un grupo terminal de 3'-fosfato es degradado por la membrana plasmática del hígado de ratón. El difosfato de trinucleótido se hidroliza rápidamente en nucleótido, mientras que el propio trinucleótido se digiere lentamente y produce productos intermedios, incluido el nucleótido. |
Alteraciones en la actividad fosfolipídica (Na++K+)-ATPase debido a la fluidez lipídica. Los efectos del colesterol y Mg2+. La ATPase (Na++K+)-activada, Mg2+-dependiente de la medulla externa del riñón de conejo se preparó en una forma parcialmente inactivada, soluble agotada de fosfolípidos endógenos, utilizando desoxicolato. Esta preparación fue reactivada de 10 a 50 veces por liposomas sonicados de fosfatidilserina, pero no por liposomas de fosfatidilserina no sonicados o liposomas de fosfatidilcolina sonicados. La enzima reconstituida se parecía a las preparaciones de membrana nativa de (Na+ + K+)-ATPase en su pH óptimo de alrededor de 7,0, mostrando una actividad óptima en las proporciones de moles de Mg2+:ATP de aproximadamente 1 y un valor de Km para ATP de 0,4 mM. Los parámetros de Arrhenius de esta actividad reactivada a un pH constante de 7,0 y un Mg2+: la relación de moles de ATP de 1:1 mostró una discontinuidad (cambio agudo de inclinación) a 17 grados C, con valores de energía de activación (Ea) de 13-15 kcal/mol por encima de esta temperatura y 30-35 kcal por debajo de ella. También se encontró una discontinuidad adicional a 8,0 grados C y el Ea por debajo de esto era muy alto (más de 100 kcal / mol). Los aumentos de concentraciones de Mg2+ en las proporciones de Mg2+:ATP por encima de 1: 1 inhiben la actividad (Na+ + K+)-ATPase y también abolieron las discontinuidades en las parcelas de Arrhenius. La adición de colesterol a la fosfatidilserina en una proporción mol 1:1 inhibe parcialmente (Na+ + K+)-reactivación de la ATPase. Las parcelas de Arrhenius en estas condiciones mostraron una única discontinuidad a 20 grados C y valores de Ea de 22 y 68 kcal/mol por encima y por debajo de esta temperatura, respectivamente. La Mg2+-ATPase insensible a la ouabaína normalmente mostró un plano lineal de Arrhenius con una Ea de 8 kcal/mol. Los liposomas mixtos colesterol-fosfatidilserina estimularon la actividad de la Mg2+-ATPase, que ahora también mostró una discontinuidad a 20 grados C con, sin embargo, un aumento de 14 kcal/mol por encima de esta temperatura y 6 kcal/mol por debajo. Los estudios cinéticos mostraron que el colesterol no tenía un efecto significativo en los valores de Km de ATP. Dado que se sabe que tanto el colesterol como el Mg2+ alteran los efectos de la temperatura en la fluidez de los fosfolípidos, los resultados anteriores se discuten en este contexto. |
Respuestas conformacionales y moleculares a la variación del pH de la adenosina trifosfatasa de membrana purificada de Micrococcus lysodeikticus. Una preparación de ATPase de las membranas de Micrococcus lysodeikticus, solubilizada y más del 95% pura, mostró dos bandas principales en la electroforesis analítica del gel de poliacrilamida. No correspondían a las isoenzimas porque una banda podía ser convertida en la otra por la exposición a un valor de pH ligeramente alcalino. La conversión fue paralela a cambios en el peso molecular, el dicroísmo circular y las propiedades catalíticas. La desnaturalización por pH a 25 grados C fue seguida por el dicroísmo circular, la ultracentrifugación y la electroforesis del gel de poliacrilamida. Una gran transición conformacional tuvo lugar en el rango ácido con puntos intermedios en aproximadamente pH = 3,6 (I = 10(-4) M), 4,3 (I = 0,03 M) y 5,3 (I = 0,1 M). La transición fue irreversible. Una fuerte agregación de la proteína ocurrió en este rango de pH. El producto final fue en gran medida bobina aleatoria, pero incluso a pH 1.5 la disociación en subunidades individuales no fue completa. Sin embargo, la disociación parcial ocurrió en pH 5 (I = 0,028 M). A este valor de pH la enzima estaba inactiva, pero el 20-30% de la actividad se podía recuperar cuando el pH se devolvió a 7.5. En la región alcalina el punto medio de la transición ocurrió cerca de pH = 11 (I = 0,028 M). El pK de la mayoría de los residuos de tirosina de la proteína fue de aproximadamente 10,9. El despliegue fue irreversible y la proteína pronto se convirtió en especies de péptidos con pesos moleculares inferiores a los determinados para las subunidades por electroforesis de gel en presencia de dodecil sulfato de sodio. La proteólisis convencional no contabilizó la transformación. |
Enfermedades de la membrana.3. Actividad de la proteasa en los leucocitos en relación con las membranas de los eritrocitos. La actividad de la proteasa se detectó en membranas de eritrocitos bovinos humanos preparados por los procedimientos convencionales que incluyen el lavado y la eliminación de la "capa buffy". La enzima fue extraída por 0,75 M KCNS o (NH4)2SO4 y fue activada por 0,4 a 0,5 M de las mismas sales. El azúcar en polvo, las fracciones de membrana y las proteínas solubles como la hemoglobina, la caseína o la albumina eran susceptibles a la hidrólisis por la proteasa membranosa. La purificación parcial de la enzima se realizó a través de la electroforesis de disco-gel en poliacrilamida en presencia de 0,25% de detergentes positivamente cargados como el bromuro de cetiltrimetilammonio. Se encontró una proteasa alcalina (pH 7,4) con propiedades similares a las de la enzima eritrocita en los leucocitos. La similitud entre las propiedades de las proteases leucocítica y eritrocítica y la correlación de la actividad en las membranas de los eritrocitos con el contenido de células blancas en estas preparaciones, sugiere que las actividades enzimáticas en los leucocitos contaminantes son responsables de la actividad de las proteases membranosas en los eritrocitos. |
[La formación de la estructura en las capas de adsorción interfásica del lysozyme en los límites del líquido]. En relación con la modelización de biomembranas regularidades de la formación y desarrollo de las capas de adsorción interfásica de lysozyme en los límites del líquido en diferentes condiciones y dependiendo de la naturaleza de la fase de carbohidratos fueron investigados por la determinación de las características mecánicas de tales capas. Las investigaciones realizadas mostraron que las capas más sólidas aparecieron bajo las condiciones que aseguraban la formación del número máximo de enlaces intermoleculares (que en un caso común se realiza con las máximas desordenancias de las macromoléculas que llegan a la interfase). |
Dependencia de la concentración del polímero de la hélice a la transición aleatoria de la bobina de un polipéptido cargado en solución salina acuosa. La transición de la hélice a la bobina de poli (ácido L-glutámico) se investigó en soluciones de cloruro de potasio acuoso de 0,05 y 0,005 M mediante la titulación potencialométrica y la medición del dicroísmo circular. La dependencia de la concentración de polímeros de la transición se observó en el rango de 0,006 a 0,04 monomol/e en 0,005 M KG1 solución. La dependencia de la concentración de polímeros puede ser interpretada por las teorías actuales de la transición de los polipéptidos cargados y de las curvas de titulación de los polielectrolitos lineales débiles teniendo en cuenta el efecto de la concentración de polímeros. |
[Relación entre fluorescencia y dicroísmo circular del complejo de la sonda de fluorescencia 4-dimethylaminochalcone con albumina sérica]. La sonda de fluorescencia (4-dimethylaminochalcone; DMH) se vinculó no covalentemente a la albumina sérica humana (HSA). La variación del pH se debió a cambios estructurales de la albumina sérica, que se determinó en términos de DMH y HSA fluorescencia y espectro de CD. Se observaron cambios considerables en la fluorescencia y el espectro de CD en pH 8 y 10, donde se produce la ionización de dos residuos de tirosina más recientemente titrados. Se asume que estos dos residuos de tirosina están en la región de unión y apagan la fluorescencia de DMH entre el pH 4 y 8. El quencimiento desaparece si estos residuos son ionizados (pH mayor que 8) o si la proteína se somete a la transición N-F (pH menor que 4). |
[Estudio de luminescencia del efecto de la temperatura en el estado de conformidad del fibrinógeno]. Se presentan los resultados de la medición de los parámetros de fluorescencia de fibrinógeno en el rango de temperatura de 20-80 grados C a diferentes pH de la solución. Se encontró que el aumento de la temperatura de 20 a 40 grados C para soluciones con pH de 4,5-9,3 no estaban acompañados por los cambios conformatorios de las macromoléculas fibrinogénicas. En el rango de temperatura de 40-50 grados C para soluciones neutrales se produjo la reconstrucción conformal de fibrinógeno de carácter indenaturado. El aumento de la temperatura por encima de 50-55 grados C produce cambios estructurales significativos de la molécula de fibrinógeno que son de naturaleza denaturante. |
[Efectos combinados de la hipoxia y la hipercapnia en el estado funcional del centro respiratorio]. Se realizaron experimentos en gatos bajo anestesia nembutal; se realizó un estudio de la actividad de pulso de las neuronas respiratorias bulbares, la actividad eléctrica del diafragma y de los músculos intercostales; se determinaron pO2, pCO2, pH, saturación de oxígeno en la sangre arterial en la acción combinada de la hipoxia y la hipercapnia. Cuando se administró una mezcla gaseosa hipóxica para la respiración, la hipocapnia en desarrollo perturbó la actividad rítmica de la descarga de las neuronas respiratorias, la respiración adquiriendo un carácter patológico del tipo Cheyne-Stokes. Después de la adición de la mezcla gaseosa hipóxica del 2% de CO2, la composición gaseosa de la sangre arterial se acercó a los valores iniciales; esta adición impidió el desarrollo de hipercapnia y trastornos de la actividad de descarga rítmica de las neuronas respiratorias. La adición de 5% de CO2 a la mezcla gaseosa hipóxica produjo un efecto negativo: en un principio intensificó y luego deprimía la actividad de pulso de las neuronas respiratorias, causó acidosis metabólica y respiratoria, y promovió asfixia. |
[Nivel de coenzimas nicotinamida en el hígado y el miocardio de las ratas envenenadas con dicloretano]. Los experimentos se realizaron en ratones machos. Se realizó un estudio del contenido de coenzimas nicotinamida en el hígado y el miocardio 24 horas después de la administración de 0,5 ml de dicloroetano en el estómago. En paralelo con el trastorno de la estructura morfológica del hígado y del miocardio, el aumento de la actividad de la alanina y las aminotransferases asparágicas en el suero sanguíneo, el dicloroetano redujo el contenido de las coenzimas nicotinamidas y perturbó la proporción de sus formas oxidadas y reducidas en estos órganos. |
[Efecto de la carbidina en los reflejos defensivos condicionados]. Se realizaron experimentos crónicos en ratas y conejos; se realizó un estudio del efecto de la carbidina en los reflejos defensivos condicionados en la estimulación de la parte mesencefálica de la formación reticular. La carbidina previno la depresión de los reflejos defensivos condicionados causados por la estimulación de la parte mesencefálica de la formación reticular. Esto indicó su influencia deprimente en las estructuras mencionadas, y fue confirmado por experimentos en conejos en el registro de cambios en las corrientes biológicas en condiciones de estimulación de la formación reticular mesencefálica. |
[Nivel de coenzimas nicotinamida en el miocardio de las ratas durante los efectos de metilxantinas (teofilina, teobromina, cafeína) y catecolaminas]. Se demostró en experimentos agudos en ratas que una hora después de una inyección intraperitoneal de teofilina (50 mg/kg) se produjo una disminución del contenido de NAD + NADP en un 19,4%, se expresó una tendencia a una disminución de NAD.H2 + NADP.H2 y se redujo el nivel total de coenzima de nicotinamida. Se observó una tendencia a disminuir el NAD + NADP y el nivel total de nucleótido de piridina después de la administración de cafeína. Se comparó la acción de catecolaminas y metilxantinas. La teobromina no produjo ningún efecto significativo en los índices estudiados. Se ha demostrado que la isadrina disminuye los niveles de NAD + NADP; la adrenalina (25 mcg/kg) aumenta el contenido tanto de las formas oxidadas (por 24%) como de las formas reducidas (por 48%) de nucleótidos de piridina. Un aumento de la dosis de adrenalina a 1000 mcg/kg fue acompañado de una reducción de las formas oxidadas (en un 22,2%) y del nivel total de coenzima de nicotinamida (en un 18%). |
Calidad del agua potable en el Condado de Georgetown. Los suministros de agua potable de 161 comunidades rurales, en el condado de Georgetown, Carolina del Sur, fueron seleccionados aleatoriamente para la recogida de muestras. El análisis mostró que la mayoría de las aguas eran ligeramente ácidas. Se encontraron concentraciones bajas pero aceptables de cloruro, cobre, fluoruro, sodio, cadmio, nitrato y fosfato. Algunas muestras de agua mostraron niveles más altos de arsénico, mercurio, zinc y plomo recomendados. Aunque sólo el 2% de las muestras superó el límite obligatorio de 0.05 ppm para el arsénico, el 72% superó el nivel recomendado de 0.01 ppm. El límite obligatorio para el manganeso se superó en el 37% de las aguas, mientras que el 88% superó el límite para el hierro. El alto contenido de hierro fue generalmente responsable de la alta turbidez encontrada en el 45% de las muestras. La profundidad del pozo y el ingreso del consumidor tenían algún impacto en la calidad del agua. La evidencia estadística sugiere que el deshielo del tanque séptico era parcialmente responsable de la contaminación de nitratos, fosfatos, hierro y arsénico de los suministros de agua superficial. Las concentraciones de plomo parecen variar según el plomo utilizado y el pH de las aguas. |
La importancia de un antrum e pylorus inervado e intacto en la prevención del reflujo duodenogástrico postoperatorio y la gastritis. Este estudio ha investigado la relación entre el reflujo duodenogástrico, la gastritis y ciertos síntomas 6-12 meses después de tres operaciones para la úlcera duodenal no complicada. Las operaciones estudiadas fueron vagotomía gástrica proximal (PGV, 20 casos), vagotomía truncal y pyloroplastia (TV+P, 22 casos) y vagotomía truncal y antrectomía (TV+A, 21 casos). El reflujo duodenogástrico se evaluó tanto por una técnica radiológica como por la medición de la concentración de bilirubina en el aspirato gástrico antes y después de la cirugía. La incidencia y la gravedad de la gastritis postoperatoria se determinaron mediante biopsia endoscópica. Los síntomas se evaluaron por puntuación sintomática y clasificación de Visick. Se observó una correlación significativa entre el reflujo duodenal y la evidencia histológica tanto de la gastritis superficial severa como de la atrofia glandular (P inferior a 0-01). También hubo una estrecha asociación entre el grado de reflujo y la presencia de quemaduras severas, dolor epigástrico y vómitos biliares después de la cirugía. La cantidad de reflujo no difirió antes de la operación. Hubo significativamente menos reflujo después de PGV que después de TV+P (P menos de 0-025) o TV+A (P menos de 0-001). Los resultados indican que una operación que preserva un antrum e pylorus inervado e intacto protegerá contra el reflujo duodenogástrico postoperatorio, la gastritis y los síntomas. |
Hemoglobina Rahere (beta Lys-Thr): Una nueva hemoglobina de alta afinidad asociada con disminución de la unión de 2, 3-difosfoglicerato y policitemia relativa. Una nueva hemoglobina con mayor afinidad al oxígeno, la beta82 (EF6) lisina conduce a la treonina (Hb Rahere), se encontró durante la investigación de un paciente que se encontró con una concentración de hemoglobina elevada después de un recuento de sangre de rutina. La sustitución afecta a uno de los sitios de unión de 2, 3-difosfoglicerato, lo que resulta en una mayor afinidad para el oxígeno, pero tanto la interacción hem-haem como el efecto alcalino de Bohr son normales en el hemólito. Esta variante tenía la misma movilidad que la hemoglobina A en electroforesis a pH alcalino pero se detectó midiendo la afinidad de oxígeno de la sangre entera; se podía separar de la hemoglobina A, sin embargo, por electroforesis en agar a pH ácido. El aumento de la concentración de hemoglobina se debió principalmente a una disminución del volumen plasmático (policitaemia relativa) y se asoció con un aumento persistente de la cantidad de sangre blanca. Este caso hace hincapié en la necesidad de medir la afinidad de oxígeno de la hemoglobina en todos los pacientes con policitemia absoluta o relativa cuando alguna causa obvia no es evidente. |
Papilotomía endoscópica y eliminación de piedras biliares. La papilotomía endoscópica se intentó en 59 pacientes con obstrucción extrahepática del sistema del conducto biliar y se realizó en 50 pacientes. Se introdujo un cuchillo especial de diatermia de alta frecuencia a través de un duodenoscopio en el conducto biliar común terminal y se incidió el techo de la papilla. En 33 de los 39 pacientes con coledocolitiasis, las piedras pasaron al duodeno espontáneamente o fueron removidas endoscópicamente. La estenosis papilar sin piedras ductales se trató con éxito con este método en ocho de los 11 pacientes. Se produjo una perforación de la unión duodenocoledocal y se reparó quirúrgicamente. La papilotomía endoscópica y la extracción de piedras es un método relativamente seguro y eficaz para el tratamiento de la icterícia extrahepatica. |
Acciones postsinápticas inhibidoras de la taurina, GABA y otros aminoácidos en los motoneurones de la médula espinal de la rana aislada. Las acciones de la glicina, la GABA, la alfa-alanina, la beta-alanina y la taurina se estudiaron mediante grabaciones intracelulares de los motoneurones lumbares de la médula espinal aislada de la rana. Todos los aminoácidos probados produjeron una reducción en la amplitud de los potenciales postsinápticos, un bloqueo del potencial de acción antidrómico y un aumento de la conductividad de la membrana. Además, se produjeron polarizaciones de membrana, que estaban siempre en la misma dirección que el IPSP. Todos estos efectos indican una acción inhibidora postsináptica de estos aminoácidos. Cuando se comparó la fuerza relativa de diferentes aminoácidos, la taurina tenía la potencia inhibidora más fuerte, seguida de beta-alanina, alfa-alanina, GABA y glicina. La strychnina y la picrotoxina aplicadas topicamente indujeron diferentes cambios en los potenciales postsinápticos, lo que indica que los distintos sistemas inhibidores podrían estar influenciados por estos dos convulsivos. Las interacciones con aminoácidos mostraron que la picrotoxina disminuyó selectivamente las acciones post-simpáticas de GABA, mientras que la strychnina redujo los efectos de la taurina, la glicina, la alfa- y la beta-alanina. Pero se pueden detectar diferencias en la susceptibilidad de estas acciones de aminoácidos a la strychnina: la acción de la taurina fue más sensiblemente bloqueada por la strychnina en comparación con la glicina, la alfa- y la beta-alanina. Con respecto a estos resultados, se discute la importancia de la taurina y el GABA como transmisores de inhibición postsináptica en las neuronas motoneuronas en la médula espinal de la rana. |
La participación de los lysophosphoglycerides en la liberación de neurotransmisores; la composición y la circulación de los fosfolípidos de las vesículas sinápticas del córtex cerebral guinea-porco y el órgano eléctrico torpedo y el efecto de la estimulación. (1) Las fracciones sinaptosómicas crudas (P2) derivadas del córtex cerebral guinea-porco se incubaron en presencia de 50 mM de KCl en un medio de glucosa de Krebs. Los órganos eléctricos de torpedo marmorata fueron estimulados eléctricamente in vivo a 5 pulsos por segundo durante 30 minutos por electrodos colocados en el lóbulo eléctrico. Las vesículas sinápticas se aislaron de cada fuente y las composiciones de fosfolípidos se analizaron y compararon con vesículas de controles no estimulados. (2) La lysophosphatidylcholine era el único lysophosphoglyceride demostrable en las vesículas sinápticas de ambas fuentes y sus niveles bajos no aumentaron como resultado de la estimulación química o electrical. En cada caso hubo una estrecha similitud de las distribuciones de fosfolípidos en las vesículas tomadas de muestras de control y estimuladas. (3) Los experimentos de control indicaron disminuciones extensas en el contenido de acetilcolina de las vesículas del órgano eléctrico estimulado y disminuciones menores en el contenido de acetilcolina de las vesículas sinápticas de las fracciones sinaptosomales crudas estimuladas. Se encontró que estas fracciones respiran linealmente en presencia de 10 mM de glucosa y se demostró que las fracciones vesiculares tienen bajos niveles de membranas contaminantes según se juzga por análisis de enzimas marcadoras. (4) Las fracciones sinaptosómicas crudas del córtex cerebral de la guinea-porco se incubaron en un medio de glucosa de Krebs con ácidos grasos etiquetados y [3H] glucosa en presencia o ausencia de 50 mM de KCl. Se realizó la fracciónción subsinaptosomal y se determinaron las radioactividades específicas de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina y fosfatidilinositol en las fracciones D (vesículas sinápticas), E (microsomas) y H (sinaptosomas perturbados). La liberación del neurotransmisor no mejoró significativamente la etiquetación de los fosfolípidos en ninguna de las fracciones estudiadas en comparación con los fosfolípidos de fracciones no estimuladas. Esto se encontró después de dos períodos de incubación y utilizando [14C]oleato, [14C]arachidonato, [3H]palmitato y [3H]glucosa. |
Respuesta de salida cardíaca al estado ácido-base alterado durante la anestesia del éter dietil. Los efectos de los cambios ácido-base en la salida cardíaca durante la anestesia del éter dietilo se estudiaron en 25 perros de mongrel preparados mediante la implantación quirúrgica de una sonda electromagnética de núcleo no ferroso envuelta en plástico en la aorta ascendente. Los hallazgos son: (1) Acidemia metabólica produjo sólo una ligera disminución en la producción cardíaca, pero una disminución más marcada se hizo evidente con la disminución del pH(2) Acidemia respiratoria llevó a un ligero aumento en la producción cardíaca. (3) Alcalemia respiratoria disminuyó la producción cardíaca. (4) La alcalemia metabólica también produjo una disminución en la producción cardíaca. |
La prevención de la autólisis de la córnea almacenada utilizando el esteroide como estabilizador de membrana de los lisosomas. Muchos ojos donados para ser utilizados en el trasplante de córnea son rechazados debido a signos de autólisis en el material del donante. El propósito de este estudio experimental era determinar si la hidrocortisona actuando como un estabilizador de membrana de los lisosomas podía prevenir o retrasar la autólisis de las córneas bajo almacenamiento, y si es así, cuál era la concentración más efectiva. Diferentes grupos de córneas de conejo fueron colocados en salina como controles o en concentraciones variables de hidrocortisona (10(-10) M a 10(-4) M a pH 7.4) a 37 grados C y 4 grados C. La fosfatasa ácida liberada después de seis horas se midió bioquímicamente. Esta enzima se utilizó como una enzima marcadora que refleja la labilización lysosomal. Los resultados mostraron una estabilización significativa de la membrana lysosomal a 4 grados C en comparación con 37 grados C. Se observó una tendencia hacia la estabilización de la membrana lysosomal cuando se utilizó la concentración 10(-8) M de hidrocortisona a 37 grados C, no habiendo estabilización demostrable a 4 grados C. |
Efectos respiratorios de las inyecciones de H+ y dinitrofenol en el espacio subarachnoide del tronco cerebral de los corderos fetales. El fluido cerebrospinal mock (pH 5,37-8,38) o 2,4-dinitrofenol (DNP) (0,15-1,5 mg) se inyectó en el espacio subarachnoide del tronco cerebral ventral de ovejas fetales exteriorizadas. Los cambios en el pH en la superficie ventral de la medulla no estimularon el esfuerzo respiratorio ni inducieron cambios cardiovasculares significativos. La respuesta respiratoria a las inyecciones de DNP varió desde la falta de respuesta a la ventilación rítmica prolongada que era independiente de los quimioreceptores periféricos o el control del pH arterial y las tensiones de gases sanguíneos. Esta inconsistencia sugiere un sitio efector algo alejado de la superficie inmediata de la medulla. La frecuencia cardíaca y la presión arterial no fueron afectados. Se concluye que el aumento de la concentración de H+ en el fluido extracelular de la medula ventral fetal no inicia la respiración, y cualquier respuesta respiratoria a los inhibidores metabólicos aplicados a esta zona no es, por lo tanto, atribuible a un cambio secundario en el pH superficial. |
Fungistasis del suelo: elevación de las necesidades exógenas de carbono y nitrógeno para la germinación de los esporos por los volátiles fungistáticos en los suelos. Las conídias axénicas, lavadas de Fusarium solani f. sp. phaseoli, Aspergillus flavus y Verticillium albo-atrum se colocaron en los discos de agar purificados de Difco lavados junto con una solución salina inorgánica que contenía varios niveles de sustitutos de carbono y nitrógeno. Estos discos fueron expuestos a volátiles de seis suelos (pH 5.1-8.6). La germinación macroconidial de Fusarium solani fue inhibida principalmente por los volátiles de suelos de pH 5.1, 6.1, 7.0 y 7.5, pero los altos niveles de glucosa y NH4Cl revertiron esta inhibición, elevando la germinación a la de los controles sin suelo, sin carbono o nitrógeno. La germinación conidial de A. flavus fue inhibida principalmente por los volátiles de los suelos de alto pH (7.0, 7.8, y 8.6), y los niveles aumentados de glucosa y una mezcla de aminoácidos anularon esta inhibición. Los volátiles de los suelos de pH 5.1, 6.1 y 7.5 estimularon la germinación conídica de A. flavus. Los ensayos después de la eliminación de CO2 del aire por encima del suelo de pH 5.1 demostraron que los volátiles inhibidores de A. flavus fueron producidos por este suelo. Los ensayos indicaron que un compuesto soluble en KOH era un suelo fungistático volátil a la germinación macroconidial de F. solani. La nullificación por sustitutos de carbono y nitrógeno de la inhibición de F. solani y A. flavus causada por los volátiles del suelo es paralela a la de la fungistasis del suelo. La germinación conidial de V. albo-atrum fue marcadamente estimulada por volátiles en todos los suelos probados, y no fue afectada por la eliminación de CO2. Los volátiles del suelo inhibidores pueden aumentar los requisitos nutricionales para la germinación de esporas de ciertos hongos. |
Enzimas que reducen la nitrofurazona en E. coli y su papel en la activación de fármacos in vivo. Los trabajos anteriores mostraron que Escherichia coli contiene al menos dos enzimas que reducen la nitrofurazona y otros derivados de nitrofuranos. Una de estas enzimas está ausente en algunas cepas mutantes resistentes a la nitrofurazona. Actualmente se informa que existen tres reductasas nitrofuranas separables en este organismo: la reductaza I (mol. de aproximadamente 50 000, insensible a O2), la reductaza IIa (mol. de aproximadamente 120 000, inhibida por oxígeno), la reductaza IIb (mol. de aproximadamente 700 000, inhibida por O2). Los metabolitos inestables formados durante la reducción de nitrofurazona por los fármacos que contienen reductases IIa y IIb producen rupturas en el ADN in vitro. Los experimentos in vivo con cepas resistentes a la nitrofurazona, que carecen de reductasa II pero contienen reductases IIa y IIb, demostraron que la letalidad, la mutación y la ruptura del ADN se incrementan considerablemente cuando las culturas se incuban bajo condiciones anaeróbicas, es decir, condiciones tales que la reductasa II es activa. Estos resultados proporcionan evidencia adicional de la importancia de la activación reductiva de nitrofurazona. |
Hidrolisis enzimática de agar: purificación y caracterización de la hidrolasa neoagarobiosa y la hidrolasa p-nitrofenil alfa-galactosida. La mezcla de polisacáridos en el componente gelante de agar (agarosa) se hidroliza a D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa por una serie de enzimas hidrolíticas obtenidas de Pseudomonas atlantica. El último paso de degradación en el camino de descomposición de la agarosa es la hidrólisis del alfa-ligazón en la disacárida neoagarobiosis dando D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa. Pseudomonas atlantica cuando se cultiva en agar produce dos enzimas específicas, p-nitrofenil alfa-galactosa hidrolasa y neoagarobiosa hidrolasa. La purificación y la caracterización parcial de ambas enzimas se presentan. |
Temperatura y pH óptima para 21 especies de hongos termófilos y termotolerantes. Se describe un medio mineral que contiene glucosa complementado con 0,01% de extracto de levadura sobre el cual crecerán todas las especies de hongos termófilos y termotolerantes probados. Trece de las 21 especies no requieren el suplemento de extracto de levadura para el crecimiento. Utilizando este medio mineral sólido y complementado, se midió el pH y la temperatura óptima para el crecimiento de todas las cepas. No se encontró correlación entre la temperatura óptima y el pH óptimo entre los miembros del grupo probado. |
Diferencias fisiológicas entre aislados de Phytophthora cinnamomi. Se observaron diferencias significativas en la actividad de la amilasa, la beta-glucosidasa y la fosfatasa entre cuatro isótopos de Phytophthora cinnamomi cultivados en suelo esterilizado modificado por nutrientes durante 20 días. El pH óptimo de la amilasa para los cuatro isótopos estaba dentro de un rango relativamente estrecho; a un pH de 5,5 cada isótopo estaba dentro del 90% de su actividad máxima. Los isótopos SB-216-1, 1-281, y C-39 mostraron la actividad beta-glucosidasa máxima en pH 5.0 y la actividad fosfatasa máxima en pH 5.0-5.5. La actividad máxima para estas dos enzimas del aislado A-7725 ocurrió a pH 3.5. En experimentos temporalizados, los isótopos 1-281 y A-7725 mostraron una mayor actividad de amilasa que los otros dos isótopos. Para la beta-glucosidasa, se observó la mayor actividad para SB-216-1; la actividad de 1-281 fue intermedia y la menor actividad se observó para los aisladores A-7725 y C-39. Los aislantes SB-216-1 y 1-281 mostraron la mayor actividad de la fosfatasa; el aislado C-39 fue intermedio en actividad, y A-7725 fue menos activo. Los resultados indican que existen diferencias significativas entre los aisladores probados y que estas diferencias pueden medirse cuantitativamente por los métodos descritos. |
Regulación y propiedades de una invertasa de Clostridium pasteurianum. Se indujo una invertasa intracelular en culturas de Clostridium pasteurianum utilizando la sacarosa como fuente de carbono para el crecimiento. Esta síntesis de enzimas podría ser reprimida por la adición de frutosa de una cultura de cultivo de sacarosa. En contraste, la actividad de la invertasa no fue afectada por la adición de glucosa a las células que crecen sacarosa y esta enzima podría inducirse en una cultura que metaboliza la glucosa por la adición de sacarosa. Esta enzima fue purificada 10.5 veces por encima de la leche inducida, EC 3.2.1.26) por estudios de especificidad de sustrato. Invertase tenía un pH óptimo de 6.5 y un Km aparente de 79.5 mM para la sacarosa, y requería una alta concentración de fosfato de potasio para la máxima actividad. Invertasa fue completamente inactivada por un tratamiento térmico de 2 minutos a 60 grados C. Esta enzima fue fuertemente inhibida por p-hidroxymercuribenzoato (pCMB) y débilmente inhibida por 5,5'-dithiobis (ácido 2-nitrobenzoico), mientras que la cisteína podría revertir sustancialmente la inhibición de pCMB, lo que sugiere que el grupo (grupos) de sulfhidrilo eran necesarios para la actividad de la invertasa. |
Estudios de caracterización de la adenosina trifosfatasa (ATPase) ligada a la membrana de Azotobacter vinelandii. La actividad de la adenosinetrifosfatasa (ATPase) (EC 3.6.1.3) en Azotobacter vinelandii se concentra en la fracción R3 membranosa que está directamente asociada con la función de transporte de electrones de Azotobacter. Las células de Azotobacter sonicamente perturbadas se examinaron para la distribución de la actividad de ATPase y la mayor actividad específica (y unidades de actividad) se encontró consistentemente en la fracción de membrana de la partícula R3 que sedimenta en ultracentrifugación a 144 000 X g durante 2 h. Cuando se aumentó el intervalo de tiempo de sonicación, la actividad de la ATPase vinculada a la membrana no podía ser ni solubilizada ni liberada en la fracción de supernatante. La actividad óptima de la ATPase ocurrió a un pH de 8,0; el ion Mg2+ cuando se agregó al ensayo fue estimulante. La actividad máxima siempre ocurrió cuando la stoichiometría de Mg2+:ATP fue de 1:1 en una relación molar en el nivel de concentración de 5 mM. Los iones de sodio y potasio no tenían efecto estimulante. La cinética de la reacción fue lineal para los intervalos de tiempo estudiados (0-60 minutos). La ATPase ligada a la membrana en la fracción R3 fue estimulada 12 veces por el tratamiento con wiTH TRypsin, y los estudios de fraccionamiento mostraron que el tratamiento con tripsina no solubilizó la actividad de la ATPase fuera de la fracción de transporte de electrones de la membrana R3. La ATPase no era fría y la temperatura durante la preparación de la fracción R3 no tuvo efecto en la actividad; refrigeración durante la noche a 4 grados C, sin embargo, resultó en una pérdida de actividad de 25% en comparación con una pérdida de 14% cuando la fracción R3 se almacenó durante la noche a 25 grados C. Una marcada inactivación (aunque variable, generalmente alrededor de 60%) ocurrió por congelación durante la noche (-20 grados C), y la ulterior sonicación no pudo restaurar la actividad de la ATPase. Esto indica que la reagregacin de membrana (por congelacion) no era responsable de la inactivacion de la ATPase. La adición de azida, ouabaína, 2,4-dinitrofenol o oligomicina al sistema de ensayo no resultó en inhibición ni estimulación de la actividad de la ATPase. La propiedad de la activación de la tripsina y que la actividad de la ATPase es la más alta en la fracción de transporte de electrones R3 sugiere que su probable papel funcional está en el acoplamiento del transporte de electrones a la fosforilación oxidativa. |
Efectos de las emisiones de fusión de zinc en la microflora del suelo forestal. Dentro de 2 km de una fundición de zinc (Zn) en Palmerton, Pennsylvania, cerca de Lehigh Water Gap, se ha medido hasta el 13,5% de Zn por peso en el horizonte O2 del suelo, y hasta el 8% de Zn en el horizonte A1. El número total de bacterias, actinomicetos y hongos (medido por cuentas de placas de dilución) se redujo considerablemente en los suelos más severamente contaminados con Zn en comparación con los suelos de control. La reducción de las poblaciones microbianas puede ser una causa parcial de la disminución de la tasa de descomposición de residuos en Lehigh Gap. El crecimiento de la mayoría de las bacterias de los sitios de control se redujo en 100 a 200 muM Zn, la mayoría de los actinomicetos en 100 muM Zn, y la mayoría de los hongos en 100 a 1000 muM Zn en el agar de extracto de Pablum delgado (TPab). Todos los actinomicetos probados y las bacterias que no forman esporas aisladas de los suelos de Lehigh Gap contaminados con Zn eran tolerantes a los Zn, creciendo normalmente en medios que contenían 600-2000 muM de Zn. La mayoría de los hongos, independientemente de la fuente, eran capaces de al menos el 50% del crecimiento normal a 700 muM Zn. Las bacterias tolerantes al zinc, los actinomicetos y los hongos se aislaron fácilmente de los suelos de bajo Zn, lo que sugiere que la selección para la tolerancia a Zn puede proceder rápidamente. Las especies acidofílicas de Mortierella han sido eliminadas selectivamente cerca de la fundición, aparentemente debido al elevado pH del suelo. Peryronellaea glomerata (Corda) Goidanich y Coniothyrium spp. Sólo se encontraron en los suelos de alta densidad. |
Activación alfa-Naphthoflavone de la 6-hidroximetilbenzo(alfa)pireno sintetasa. La alfa-Naphthoflavona activa la síntesis arilo-hidroximetil de las enzimas microsomales y solubles del hígado de ratón y los pulmones de ratón. La enzima cataliza la hidroximetilación del benzo(alfa)pireno al derivado 6-hidroximetilo. |
Efectos de la administración continua de N, N-dimetil-4-fenilazoanilina (DAB) sobre las actividades e inductibilidades de algunas enzimas metabolizadoras de fármacos en el hígado de ratas. (1) Se estudió el efecto de la alimentación de una dieta relativamente baja en proteínas que contenga 0,06% de DAB durante 29 semanas sobre la actividad de la DAB-azorreductasa, la nitrorreductasa (ácido p-nitrobenzoico), la N-oxidasa (N,N-dimetililinina), la N-demetilasa (DAB), el citocromo P-450, la NADPH-citocromo c reductasa, la beta-glucuronidasa y la arilsulfatasa A. Se produjeron rápidas disminuciones en la actividad de las primeras seis enzimas, alcanzando valores mínimos en entre 4 y 8 semanas. Las actividades aumentaron en todos los casos para controlar o alcanzar los niveles de control. Esta tasa de aumento fue la más baja para el citocromo P-450. A las 4 semanas, la actividad de la azoreductasa con el agente quimioterápico CB10-252 (I) como substrato fue significativamente mayor que en las ratas de control. Los primeros aumentos se produjeron en las actividades de la beta-glucuronidasa y la arilsulfatasa A y la actividad de esta última nunca cayó por debajo del nivel controlado. (2) Se realizó una investigación sobre los efectos diferenciales de la alimentación de colorantes en algunas de las actividades de las enzimas en los dos lobos hepáticos principales y se encontraron diferencias. (3) El efecto del pretratamiento con fenobarbital (PB) en las ratas alimentadas con DAB se estudió a intervalos de 4 semanas. Las actividades de la DAB-azorreductasa y de la nitrorreductasa aumentaron durante todo el período, mientras que las actividades de las enzimas lisosómicas disminuyeron. (4) Después de la alimentación de DAB durante 4 semanas, el efecto de PB y 3-metilcolantreno (MC) sobre las actividades de DAB-azorreductasa, CB10-252-azorreductasa y componentes de las azorreductases-citocromo P-450, NADPH-citocromo c reductasa, la CO-CB10-252-azorreductasa no fue inducida por PB o MC, y CO no inhibió su reducción. Su reducción dependía sólo ligeramente de NADH. CO causó una mayor disminución relativa de la actividad de la DAB-azorreductasa en los animales alimentados con colorantes y también en los animales después del pretratamiento de PB y MC, lo que implica un mayor papel del citocromo P-450 en los animales alimentados con colorantes. |
Algunas características de dos sistemas de azorreductasa en el hígado de ratas. Relevancia para la actividad del ácido benzoico 2-[4'-di(2"-bromopropil)-aminophenylazo] (CB10-252), un compuesto que posee actividad citotóxica latente. Se ha demostrado que el sistema involucrado en la reducción de 2-[4'-di(2''-bromopropilo) aminofenilbenzoico ácido (CB10-252), un agente diseñado para tratar el cáncer de células primarias del hígado, se localiza principalmente en la fracción supernatante de 108 000 g de hígado de ratón homogenado. También está presente en otros órganos, especialmente en la médula espinal. DAB-azorreductasa como se mostró anteriormente está presente casi enteramente en la fracción microsomal y se encuentra en alta concentración sólo en el hígado. El pH máximo para la CB10-252-azorreductasa implica la importancia del grupo 2'-carboxilo en la determinación de la especificidad del substrato. El uso de inhibidores de enzimas y otros aditivos mostró que CB10-252 NO FUE AXANTHINE OXIDASE O DIHYDROFOLATE REDUCTASE. Su actividad no fue afectada por el monóxido de carbono, fenobarbitona (PB), o 3-metilcolantreno (MC) pretratamiento. La mejora de la actividad por iones de hierro y FAD indicó que al menos parte del sistema de reducción podría involucrar una flavoproteína con FAD como el grupo prótesis. La actividad de la CB10-252-azorreductasa y la metilazorreductasa se redujo por la menadiona (vitamina K3), el cianuro y el propilgalato. Una preparación de diaforasa del corazón de cerdo redujo tanto el CB10-252 como el metilado con los sistemas generadores de NADPH y NADH. |
Inhibición de mercurio del complejo de síntesis de ácidos grasos avianos. (1) Las inyecciones subcutáneas o intra-abdominales de 8 mg de HgCl2/100 g de peso corporal suprimieron notablemente la actividad de síntesis de ácidos grasos hepáticos de los pollos a 1 h después de la inyección. La depresión ocurrió a pesar del hecho de que los pollos continuaron comiendo hasta el momento en que fueron asesinados. Bajo estas mismas condiciones, la actividad hepática de la acetil-CoA carboxilasa (EC 6.4.1.2) no fue afectada por HgCl2, mientras que la actividad del sistema mitocondrial de elongación de ácidos grasos fue estimulada. (2) Cuando el 2-mercaptoetanol se incluyó en el medio de incubación para una preparación altamente purificada de la síntesis de ácidos grasos, se requería 500 muM de HgCl2 para mostrar una inhibición definitiva de la enzima. Cuando se omitió el 2-mercaptoetanol, 50 muM de HgCl2 era inhibidor y 100 muM de HgCl2 abolió la actividad enzimática. (3) 2 mM de dithiotreitol protege completamente la preparación de la síntesis de ácidos grasos purificados de la inhibición por 100 mM de HgCl2. Cuando se añadió dithiotreitol después de la adición de la enzima al medio que contenía mercurio, la protección de la enzima no era completa. (4) Diálisis de fracciones de citosol de pollos inyectados con HgCl2 contra 500 vol. El buffer de 0,2 M de fosfato de potasio (pH 7.0) que contenía 1 mM de EDTA y 10 mM de dithiotreitol durante 4 horas a 4 grados estimuló la actividad de la síntesis de ácidos grasos de las fracciones. La diálisis de las fracciones de citosol de gallinas no inyectadas en las mismas condiciones no tuvo efecto en la actividad de la síntesis de ácidos grasos. (5) Estos datos apoyan la hipótesis de que el efecto inhibidor de HgCl2 administrado in vivo sobre la actividad de la síntesis de ácidos grasos hepáticos en pollos se media a través de la interacción del mercurio con los grupos sulfhidrílicos de la enzima. |
[Fosfolipasa básica de Naja nigricollis venom]. Se ha confirmado que el veneno de N. nigricollis contiene varias fosfolipases una de ellas es una fosfolipasa básica A. Esta enzima es tóxica para ratones cuando se inyecta por vía intravenosa. In vitro reacciona con la lecitina del amarillo de huevo que produce lysolecitina y previene el fenómeno de la coagulación de la sangre. Se ha establecido una identidad inmunológica entre esta fosfolipasa básica y dos fosfolipases ácidas presentes en el mismo veneno. |
[Mortalidad espontánea y lesiones vasculares en 3 cepas de ratones con diferentes niveles de presión arterial]. Hemos observado una mortalidad alta y significativa en ratas hipertensas espontáneamente en comparación con los controles normotensivos y hipotensivos, en la quinta generación. Las ratas hipertensivas mostraron una alta frecuencia de hemorragia cerebral y periarteritis nodosa. |
Efectos de la disminución de la presión arterial en el flujo sanguíneo cerebral en el diablo. Influencia del sistema nervioso simpático. La influencia del sistema nervioso simpático en la respuesta circulatoria del cerebro a la reducción graduada de la presión arterial media se estudió en babones anestesiados. El flujo sanguíneo cerebral se midió por el método de depuración 133Xe, y la presión arterial se redujo por la hemorragia controlada. En los abejorros normales, la constante del flujo sanguíneo cerebral se mantuvo hasta que la presión arterial media fue de aproximadamente el 65% del valor de base; después, el flujo sanguíneo cerebral disminuyó cuando la presión arterial se redujo. La simpatectomía cervical superior de 2-3 semanas de duración no afectó a la respuesta normal. En contraste, tanto la simpatectomía quirúrgica aguda (división del tronco cervical) como el bloqueo del receptor alfa (1,5 mg/kg de fenoxibenzamina) aumentaron el mantenimiento del flujo sanguíneo cerebral frente a la hipotensión hemorrágica en que el flujo sanguíneo cerebral no disminuyó hasta que la presión arterial media era de aproximadamente el 35% del valor de base. Los resultados indican que el sistema nervioso simpático no está involucrado en el mantenimiento del flujo sanguíneo cerebral frente a una caída de la presión arterial. De hecho, la implicación es que la descarga simpaticoadrenal que acompaña la hipotensión hemorrágica es perjudicial para, en lugar de ser responsable de, la autorregulación cerebral. |
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in Data Studio
TransCorpus-bio-es
TransCorpus-bio-es is a large-scale, parallel biomedical corpus consisting of Spanish synthetic translations of PubMed abstracts. This dataset was created using the TransCorpus framework and is designed to enable high-quality Spanish biomedical language modeling and downstream NLP research.
Dataset Details
- Source: PubMed abstracts (English)
- Target: Spanish (synthetic, machine-translated)
- Translation Model: M2M-100 (1.2B) using TransCorpus Toolkit
- Size: 22 million abstracts, 34.6GB of text
- Domain: Biomedical, clinical, life sciences
- Format: one abstract per line
Motivation
Spanish is a low-resource language for biomedical NLP, with limited availability of large, high-quality corpora. TransCorpus-bio-es bridges this gap by leveraging state-of-the-art neural machine translation to generate a massive, high-quality synthetic corpus, enabling robust pretraining and evaluation of Spanish biomedical language models.
from datasets import load_dataset
dataset = load_dataset("jknafou/TransCorpus-bio-es", split="train")
print(dataset)
# Output:
# Dataset({
# features: ['text'],
# num_rows: 21567136
# })
print(dataset[0])
# {'text': '[Estudios bioquímicos sobre los componentes de la camomila/III. Estudios in vitro sobre la actividad antipéptica de (--)-alfa-bisabolol (transl del autor)]. (--)-Alfa-Bisabolol tiene una acción antipéptica primaria dependiendo de la dosis, que no es causada por una alteración del valor de pH. La actividad proteolítica de la pepsina se reduce en un 50 por ciento por la adición de bisabolol en la proporción de 1/0,5. La acción antipéptica del bisabolol sólo ocurre en caso de contacto directo. En caso de contacto previo con el substrato, se pierde el efecto inhibidor. '}
Benchmark Results in our French Experiment
TransBERT-bio-fr pretrained on TransCorpus-bio-fr achieve state-of-the-art results on the French biomedical benchmark DrBenchmark, outperforming both general-domain and previous domain-specific models on classification, NER, POS, and STS tasks. See TransBERT-bio-fr for details.
Why Synthetic Translation?
- Scalable: Enables creation of large-scale corpora for any language with a strong MT system.
- Effective: Supports state-of-the-art performance in downstream tasks.
- Accessible: Makes domain-specific NLP feasible for any languages.
Citation
If you use this corpus, please cite:
@misc{knafou-transbert,
author = {Knafou, Julien and Mottin, Luc and Ana\"{i}s, Mottaz and Alexandre, Flament and Ruch, Patrick},
title = {TransBERT: A Framework for Synthetic Translation in Domain-Specific Language Modeling},
year = {2025},
note = {Submitted to EMNLP2025. Anonymous ACL submission available:},
url = {https://transbert.s3.text-analytics.ch/TransBERT.pdf},
}
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